帕金森病又称震颤麻痹 ,是神经系统常见的慢性进行性退行性疾病 ,于 1 81 7年由英国人JamesParkinson首次描述 ,典型症状为静止震颤(testingtremor)、肌肉僵硬 (rigidity)、运动迟缓(bradykinesia)和姿势反射受损。 1 960～ 1 962年Hornykiewicz发现 ,病人的黑质部位多巴胺 (DA)神经元严重退变超过 80 %以上时 ,DA对基底神经节间接回路的去抑制和对直接回路的兴奋两种功能严重丧失 ,导致运动障碍。基底神经节是维持机体运动功能的皮层下中枢 ,其中与运动功能关系最密切的是纹状体 ,它接受来自大脑皮层兴奋性谷氨酸 ( glutamate ,Glu)能投射和黑质致密部的DA能输入 ,发出直接和间接两条通路。纹状体投射到苍白球内侧 (Gpi)、外侧 (Gpe)以及黑质网状部 (SNr)的投射神经元虽然都是GABA能的 ,但在这两神经核中 ,与GA BA共存的神经肽类 (调质 )是不相同的。直接回路的GABA能纤维从纹状体投射到Gpi和SNr,伴随的调质是强啡肽 (DYN) ,受D1受体的调节 ;而间接回路的GABA纤维 ,从纹状体投射到Gpe ,与脑啡肽 (ENK)共存 ,受D2受体的调节<1 > 。大量研究结果表明 ,在PD啮齿类动物模型中 ,PPDmRNA表达下调<2 > ,或PPEmRNA表达上调与纹状体DA的丢失有着密切的关联<3> 。还有研究证实 ,γ 氨基丁酸与PD的发病密切相关 ,DA能神经元接受GABA能神经元的调控 ,GABA能神经元也可介导其他神经递质发挥作用。根据目前PD的最新统计资料表明 ,我国 5 5岁和 75岁以上患病比率分别为 1 %和 2 5 %。但由于迄今PD的发病机制仍不完全清楚 ,还没有一种药物最终表明可以减缓、阻止甚至逆转PD中神经元的退行变性过程 ,因此激励人们开发多种治疗药物 ,其中中药治疗在提高PD治疗效果、减少不良反应和控制PD的一些非运动障碍症状等方面取得了一定的成效。本课题组以往的研究发现 ,人参皂苷Re具有明显的抗黑质神经元细胞凋亡的作用。故作者旨在探讨人参皂苷Re对黑质致密部DA能神经元的保护作用并探讨其可能机制。作者应用MPTP制备C5 7BL小鼠PD模型运用RT PCR、免疫组织化学以及图像分析等技术分别对纹状体PPEmRNA、PPDmRNA的表达水平和黑质TH、GABA阳性细胞数等多项指标进行了考察 ,并发现用人参皂苷Re预处理后对多巴胺能神经元具有一定的保护作用。1 材料与试药 C5 7BL小鼠由天津血液病防治中心动物室提供 ,合格证号 :辽实动合字 0 35号。MPTP(美国Sigma公司 ) ,人参皂苷Re(含量 :96 2 4 % ,沈阳药科大学植化教研室提供 ) ,TH抗血清 (美国Sigma公司 ) ,GABA抗血清 (美国Sigma公司 ) ,牛血清白蛋白 (bovineserumalbu min ,BSA ,美国Bochringer公司 ,上海化学试剂站分装厂分装 ) ,卵白素 生物素复合物 (avidinbiotincomplexKit,ABC Kit,美国Sigma公司 ) ,3,3 二氨基联苯胺 (diaminobenzidine ,DAB ,美国Sigma公司 ) ,0 1 % ( φ)二乙基焦碳酸 (diethylpyrocar bonate,DEPC ,美国Sigma公司 ) ,Trizol(GIBICO ,InvitrogenCorporation) ,RT PCR药盒 (TaKaRaRNAPCRVer 2 1kit,购自宝生物工程大连有限公司 ) ,多巴胺 (dopamine ,DA ,美国Sigma公司 ) ,高香草酸 (homovanillicacid ,HVA ,美国Sig ma公司 )。高效液相色谱仪 :Waters 60 0 0 0A恒流泵 ,WatersU6K进样器 ,Waters 464电化学检测器(美国 )。2 方法2 1 造模与给药8、9周龄C5 7BL小鼠 40只 ,雌雄各半 ,体质量 ( 2 0± 2 ) g。随机分为 5组。MPTP组 :小鼠每天上午 1 1时皮下注射MPTP 2 0mg·kg- 1 ,连续8d ;预防高、中、低剂量组 :不同剂量的Re( 6 5、1 3 0、2 6 0mg·kg- 1 )在造模前 5d开始每天上午9时灌胃Re ,连续 1 3d持续到造模结束 ;对照组 :灌胃等容量生理盐水。每次注射药物后均观察小鼠行为变化。2 2 标本采集与组织切片各组小鼠于末次注射药物后次日断头 ,冰上剥脑 ,取双侧尾核 - 80℃保存 ,余脑组织浸于4% (w)多聚甲醛中固定 2周 ,再换入含 2 0 % (w)蔗糖的 0 0 1mmol·L- 1 磷酸盐缓冲液 (PBS)中 ,待脑组织下沉后用恒冷切片机切取 30 μm 厚冠状平面的脑片。2 3 行为学实验各组小鼠于实验前 4d进行每日 2次爬杆、悬挂、游泳行为训练。在给药期间至处死动物前 ,每日下午 1 :0 0 (注射MPTP后 2h)分别进行爬杆实验 ( poletest)、悬挂实验 (tractiontest)和游泳实验 (swimmingtest)的行为测验以检测其肢体运动协调情况<4> 。2 4 免疫组织化学 (Immunohistochemistry,ICC)技术免疫组织化学采用ABC法。脑片用0 0 1mmol·L- 1 PBS ( pH 7 4)振荡漂洗 3次 ,每次 3min ;于含 1 % ( φ)H2 O2 的 1 % (w)BSA孵育1h后加入第一抗体 (TH以PBS稀释 1 0 0 0倍 ,GABA以PBS稀释 80 0倍 ) ,4℃孵育过夜 ;再分别与生物素标记的二抗IgG血清 (以PBS稀释2 0 0倍 )室温孵育 1h ;与卵白素 生物素复合物(ABC ,VA∶VB∶VPBS=1∶1∶40 0 )室温下孵育 2h ;用新鲜配置的含有 0 0 1 % ( φ)H2 O2 、0 0 5 % (w)DAB的PBS显色 ,适时用PBS终止反应。以上各步骤间均用PBS漂洗脑片 3次 ,每次 1 0min。免疫组织化学对照组不加第一抗体 ,用PBS代替 ,其余步骤同前。贴片 ,晾干 ,乙醇梯度脱水 ,二甲苯透明 ,中性树胶封片 ,光镜下观察并摄片。参照GeorgePaxinos&CharlesWatson的大鼠脑图谱 ,用HPIAS系列彩色病理图文分析系统对脑片黑质致密部 (SNc)或网状部 (SNr)进行细胞计数。在 1 0×物镜下选定位置 ,锁定测量框 ,统计测量框内阳性神经元的个数 ,每张脑片计数3或 4个部位 ,取平均值。2 5 RT PCR法检测脑内PPEmRNA和PPDmRNA在纹状体中的表达2 5 1 总RNA的提取取各小鼠左侧尾核 ( 2只小鼠约 40～ 60mg)加Trizol 1mL ,匀浆 ;加 0 2mL氯仿摇匀 ,分层后离心 2 0min( 1 2 0 0 0r·min- 1 ) ;上层水相移至新管 ,加 0 5mL异丙醇 ,离心 30min( 1 2 0 0 0r·min- 1 ) ;弃上清 ,加 75 % ( φ)乙醇0 5mL ,清洗 ,再离心 5min( 75 0 0r·min- 1 ) ,如此清洗 2、3次。蒸馏水 30 μL溶解RNA ,分光光度计测A2 60 /A2 80 比值为 1 7～ 2 0 ,1 % (w)琼脂糖凝胶电泳观察 1 8S与 2 8S条带密度比值约等于 2 ,确保RNA的纯度和完整性。2 5 2 引物设计引物由宝生物工程 (大连 )有限公司合成 ,结果见表 1。Table 1 PrimerPrimerForwardandreverseprimer LengthofextentproductGAPDHf 5′ ACGGCAAATTCAACGGCACAGTCA 3′ 2 5 1bpr 5′ CTGGGGGCATCGGCAGAAGG 3′PPEf 5 ′GTCCACCATTGGTTCAGAAGG 3′ 72 3bpr 5 ′ACCGCATAAAGCCTCCGTATC 3′PPDf 5 ′CTGGCACGCTCCATTTCAAC 3′ 30 1bpr 5 ′CAAACATCTAAATCTTCGGAATAGG 3′2 5 3 逆转录反应总反应体积 2× 1 0 - 5 L ,包括MgCl25mmol·L- 1 、dNTP混合物 1mmol·L- 1 、RNA酶抑制剂 1× 1 0 6 U·L- 1 、逆转录酶 2 5× 1 0 5 U·L- 1 、随机引物 2 5 μmol·L- 1 、RNA样品 1 μg。反应条件 :30℃、1 0min ,42℃、60min ,99℃、5min ,5℃、5min。2 5 4 聚合酶链反应总反应体积 1× 1 0 - 6 L ,包括MgCl22 5mmol·L- 1 、Taq酶 2 5× 1 0 4 U·L- 1 、上下游引物各 0 2 μmol·L- 1 、逆转录产物 2× 1 0 - 5 L。反应条件 :94℃、30s ,5 8℃、30s,72℃、90s ,30个循环 ,终末延伸 72℃、5min。2 5 5 定量分析RT PCR产物 6μL进行 1 % (w)琼脂糖凝胶电泳 ,凝胶分析系统定量分析扩增产物的平均光密度 ,计算目的基因与内参的比值。2 6 纹状体内多巴胺和高香草酸的含量2 6 1 色谱条件色谱柱 :Nova
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