替米沙坦 (telmisartan)为新型非肽类血管紧张素受体Ⅱ拮抗剂 ,用于治疗高血压。临床研究表明 ,每日口服一次本品可产生 2 4小时降压作用。Stanger等<1～ 3> 以柱切换高效液相荧沟法 (HPLC FLD)测定血浆中替米沙坦 ,该法血浆样品处理过程较为烦琐 ,分析时间过长。赵志刚等<4 > 以固相萃取LC MS法测定血浆中替米沙坦 ,最小检出浓度为 0 5μg/L ,但样品前处理仍需经SPE小柱纯化、氮气吹干和流动相溶解样品等复杂过程 ,每个样品的LC MS分析测定时间长达 8min ,每次测定所需样品量多达1mL。本文建立了快速测定血浆中替米沙坦的HPLC ESI MS方法 ,所需血浆体积仅为 1 0 0 μL ,1个样品的测定时间仅需 3 5min ,一天能测定 30 0多个样品 ,能快速而简便地分析大量的血浆样品。本文用该法研究 2 0名健康受试者口服国产替米沙坦片和进口替米沙坦片的体内过程 ,并对两种替米沙坦片剂的生物等效性进行评价。1 实验材料1 1 仪器Agilent1 1 0 0液相色谱 -质谱联用仪 (美国Agilent公司 ) ;AgilentChemStation(美国Agilent公司 ) ;TGL 1 6B高速离心机 (上海安亭科学仪器厂 ) ;旋涡振荡混和器 (上海医科大学仪器厂 )。1 2 药品和试剂替米沙坦对照品 (江苏万邦生化医药股份有限公司 ,含量 99 8%) ;坎地沙坦酯 (内标 ,江苏药物研究所 ,含量 99 7%) ;替米沙坦片 (供试制剂 ,江苏万邦生化医药股份有限公司产品 ,批号 :0 30 4 2 2 ,规格 :4 0mg/片 ) ;美卡素 (替米沙坦片 ,参比制剂 ,德国勃林格殷格翰国际公司产品 ,批号 :1 0 75 6 7,规格 :4 0mg/片 ) ;甲醇 (色谱纯 ,德国Merck公司 ) ;乙腈 (色谱纯 ,德国Merck公司 ) ;乙酸铵为分析纯 ;水为去离子纯净水。2 实验方法2 1 色谱与质谱条件色谱柱 :LichrospherODS (1 5 0mm× 4 6mm ,5 μm,淮阴汉邦科技有限公司 ) ;流动相 :1 0mmol/L乙酸铵缓冲液 (pH 3 5 ) 甲醇 (9∶91 ,V/V) ;柱温 :2 5℃ ;进样量为 80 μL ;离子极性 :正离子 ;离子化方式 :气动辅助电喷雾离子化 ;离子检测方式 :选择性离子检测 (SIM) ;检测离子 (m/z) :5 1 5 5 (
替米沙坦+)、4 2 3 4 (内标碎片离子 ) ;传输区电压 :1 2 0V ;干燥气流速 :1 0L/min ;雾化室压力 :2 76kPa ;干燥气温度 :35 0℃。2 2 血浆样品的处理于 1mL离心管中精密加入内标溶液 (含坎地沙坦酯 1 2 5 0mg/L) 4 0 μL ,以氮气流吹干 ,精密加入血浆样品 1 0 0 μL ,旋涡 3秒混匀 ,加入乙腈 4 0 0 μL ,旋涡 2分钟 ,离心 (1 6 0 0 0r/min) 2分钟 ,吸取上清液2 5 0 μL转移至自动进样器样品管中 ,加入 0 5 %乙酸的乙腈溶液 5 0 μL ,混匀 ,进行HPLC ESI MS分析。2 3 临床实验方案2 0名男性健康受试者 ,体重 5 4～ 76kg ,年龄 2 0～ 30岁。经体检证明 ,肝、肾功能正常 ,心电图正常。实验前两周及实验期间未服用其它任何药物 ,实验期间统一饮食。采用双交叉实验设计 :2 0名男性健康受试者随机分成A、B两组 ,A组先口服供试制剂 ,再口服参比制剂 ;B组先口服参比制剂 ,再口服供试制剂。剂量均为 4 0mg。两次服药间隔 1 4天的清洗期。受试者于实验前 1周和实验期内均不饮用酒类和咖啡类饮料 ,试验前禁食过夜至少 1 0小时(不禁水 ) ,于次日早晨 7:30空腹服用供试制剂或参比制剂 ,用 2 5 0mL温开水送服 ;服药 2小时后方可再饮水 ,4小时后进统一餐。受试者于服药前及服药后 2 0 ,4 0分钟及 1 ,1 5 ,2 ,3,4 ,6 ,9,1 2 ,2 4 ,4 8,72 ,96小时分别采血 1mL于肝素化试管中 ,分取血浆 ,于 - 2 0℃保存待测。2 4 数据分析将所得血药浓度 -时间数据经自然对数转换后 ,用最小二乘法对尾段相回归计算消除速率常数k ,Cmax及Tmax均为实测值 ;消除半衰期 (t1/2 )、曲线下面积 (AUC)分别按下列各式估算 :t1/2 =0 6 93/kAUC0 96 =∑ (CI+Ci- 1)·(ti-ti- 1) / 2AUC0 ∞ =AUC0 96 +C96 /k式中C96 为最后取样点浓度 ,k为末端消除速率常数。所得参数 (Tmax,Cmax,AUC0 96 ,AUC0 ∞)用交叉试验设计的方差分析 ,其中Cmax,AUC0 96 ,AUC0 ∞ 经自然对数转换后先进行方差分析 ,然后进行双单侧t检验并计算 90 %置信区间。3 实验结果3 1 色谱行为在本实验所采用的HPLC MS条件下 ,替米沙坦的保留时间约为 2 2min ,内标的保留时间约为2 6min。替米沙坦和内标峰形良好 ,无杂峰干扰测定。本方法具有较高的专属性 (见图 1 )。 1个样品的测定时间仅需 3 5min ,一天能测定 30 0多个样品。3 2 血浆中替米沙坦标准曲线制备及灵敏度取 1mL离心管数支 ,分别精密加入适量的替米沙坦对照品溶液和内标溶液 (含坎地沙坦酯 1 2 5 0mg/L) 4 0 μL ,以氮气流吹干 ,加入空白血浆 1 0 0 μL ,旋涡 3秒混匀 ,配成含替米沙坦的浓度分别为0 30 1 2 ,1 0 0 4 ,3 0 1 2 ,1 0 0 4 ,2 5 1 0 ,5 0 2 0 ,1 0 0 4 ,2 5 1 0 ,4 0 1 6 ,6 0 2 4 μg/L的含药血浆 ,每种浓度各取 5份 ,按“2 2”项下操作 ,记录色谱图 ,计算替米沙坦峰面积 (As)和内标峰面积 (Ai)的比值f,再以f对血药浓度C作回归计算 ,得回归方程如下 :f=8 970× 1 0 - 3C + 4 0 0 0× 1 0 - 3(二次权重 ,r=0 9989) ,线性范围为 0 30 1 2～ 6 0 2 4 μg/L。按上述条件测得替米沙坦在血浆中的最低定量限为 0 30 1 2 μg/L(S/N≈ 1 0 )。A :空白血浆 ;B :加入替米沙坦对照品和内标对照品后的血浆 ;C :健康受试者口服替米沙坦的血浆 (加内标 )图 1 不同样品的色谱图(Fig 1 . Typicalchromatogramsofdifferentsamples)3 3 精密度试验取 1mL离心管数支 ,按“3 2”项下制备含替米沙坦浓度分别为 3 0 1 2 ,2 5 1 0 ,1 0 0 4 ,4 0 1 6 μg/L的含药血浆 ,按“2 2”项下操作 ,在日内和日间 (5天 )对每种浓度各做 5份样品 ,进样测定 ,记录色谱图 ,计算替米沙坦峰面积 (As)和内标峰面积 (Ai)的比值f,并计算每份样品中替米沙坦的浓度 ,求得日内和日间精密度 ,日内和日间相对标准偏差均小于10 %,符合生物样品分析方法的基本要求 (见表 1 )。3 4 相对回收率试验取 1mL离心管数支 ,按“3 2”项下制备含替米沙坦浓度分别为 3 0 1 2 ,2 5 1 0 ,1 0 0 4 ,4 0 1 6 μg/L的含药血浆 ,按“2 2”项下操作 ,每种浓度各取 5份 ,进样测定 ,记录色谱图 ,计算f值 ,将该值代入随行标准曲线方程 ,计算所得浓度与加入浓度的比值 ,即为相对回收率 ,结果见表 2。表 1 血浆中各种浓度替米沙坦测定的日内和日间精密度(Tab 1 . Precisionoftelmisartaninblankplasma) ( x±s,n =5 )加入浓度(μg/L)日内值所测值(μg/L)RSD(%)日间值所测值(μg/L)RSD(%)3 0 1 2 3 347± 0 1 2 1 4 3 6 3 30 9± 0 1 2 783 92 5 1 0 2 5 95± 0 4 5 2 0 1 72 5 91± 1 1 934 61 0 0 4 98 90± 1 5 2 0 1 5 1 0 0 6± 3 95 2 3 94 0 1 6 395 6± 4 6 4 5 1 2 4 0 3 4± 1 4 5 2 3 6表 2 血浆中替米沙坦的相对回收率 ( x±s)(Tab 2 . Relativerecoveryoftelmisartaninblankplasma)加入浓度 (μg/L) 相对回收率RSD(%)3 0 1 2 1 1 1 3± 4 0 31 3 62 5 1 0 1 0 3 4± 1 80 1 1 71 0 0 4 98 5 1± 1 1 5 4 1 54 0 1 6 98 5 1± 1 1 5 7 1 23 5 绝对回收率试验取 1mL离心管数支 ,精密加入不同量的替米沙坦对照品溶液 ,加入甲醇配成浓度分别为 3 0 1 2 ,2 5 1 0 ,1 0 0 4 ,4 0 1 6 μg/L的替米沙坦溶液 ,每种浓度各取
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