红豆杉科Taxaceae榧属Torreya植物 ,经笔者研究认为共有8个原种和8个栽培品种<1>,我国有5个原种、8个栽培品种及1个引进栽培种 ,即榧树T grandis、九龙山榧T jiulongs_hanensis(新组合 )、长叶榧T jackii、巴山榧T fargesii、云南榧T yunnanensis和香榧T grandiscv merrillii等8个栽培品种以及1个引进栽培种日本榧T nucifera。笔者在对榧属植物进行较系统研究的同时<1 ,2>,首次提取了其中长叶榧种子中的多糖并测定了其含量 ,同时应用高效毛细管电泳构建了多糖的指纹图谱<3>,以为进一步综合开发利用榧属植物资源提供科学依据。1材料与条件1 1药材长叶榧种子分别采自浙江省诸暨市东溪乡 (样品A )、浙江省仙居县淡竹乡 (样品B)和福建省建瓯县 (样品C) ,经第二军医大学药学院郑汉臣教授鉴定为红豆杉科植物长叶榧TorreyajackiiChun 的成熟种子 ,凭证标本存放于第二军医大学药学院生药教研室。1 2试剂无水葡萄糖对照品、苯酚、浓硫酸均为分析纯。5 %苯酚的精制 :称取苯酚50g ,加0 05g铝片 ,0 025g碳酸氢钠 ,蒸馏 ,收集馏分。称取馏分15g,加水溶解并稀释至300ml ,摇匀 ,置于棕色瓶中 ,备用。1 3仪器UV -3000型紫外分光光谱仪 (日本Shimadzu公司 ) ;2F -1型三用紫外分析仪 (上海顾村电光仪器厂 ) ;R200D型电子天平 (德国沙多利士公司 )。BioFocus3000型毛细管电泳仪(美国Biorad公司 ,配有紫外扫描检测器 ) ;熔融石英毛细管75μm×60cm(河北永年光纤厂 )。1 4电泳条件电解缓冲液为300mmol/L硼酸盐溶液 (pH=8 5) ,电压为20kV ,温度为20℃ ,紫外检测波长为260nm ,重力进样时间5s。开机后先用0 1mol/L氢氧化钠冲洗毛细管2min ,再用去离子水冲洗5min ,然后用缓冲液冲洗至基线平稳后开始进样。每两次进样之间设定缓冲液冲洗2min。1 5多糖含量测定条件狭缝宽度2nm ,扫描速度快 ,记录纸范围20nm/cm ,检测波长为490nm。2方法<4>2 1长叶榧种子多糖的提取与精制取长叶榧子种仁适量 ,60℃烘干 ,粉碎 ,过20目筛。称取100g 置于1000ml圆底烧瓶中 ,加入80 %乙醇900ml ,浸泡过夜 ,90℃回流1h ,趁热过滤。滤渣加入800ml水 ,浸泡1h ,90℃温浸1h ,滤过 ,药渣加水400ml ,90℃温浸30min ,滤过 ,合并滤液 ,减压浓缩至100ml ,用氯仿萃取3次 ,水层加1 %活性炭脱色2次 ,抽滤 ,滤液加85 %乙醇使醇含量达80 % ,置于冰箱中放置过夜。滤过 ,残渣先后用85 %乙醇、无水乙醇和丙酮依次洗涤3次。将样品置于真空干燥器中干燥 ,得精制长叶榧子多糖。2 2对照品溶液的制备精密称取105℃干燥至恒重的葡萄糖28 5mg,加水溶解并定量至100ml。2 3标准曲线的绘制分别精密吸取对照品溶液1 0、3 0、5 0、7 0、9 0、11 0、13 0ml ,分别置于50ml容量瓶中 ,加水稀释至刻度。各精密吸取2 0ml ,置于具塞试管中 ,加入5 %苯酚溶液1 0ml ,再垂直加入5 0ml浓硫酸 ,静置5min ,振摇 ,置于沸水中保温15min ,冷却 ,在490nm波长处测吸收度。以葡萄糖量 (mg)为横坐标(X) ,吸收度为纵坐标 (Y ) ,绘标准曲线。得回归方程Y=36 3388×10-3X +1 1645×10-3(r=0 9944)。2 4换算因子的测定精密称取“2 1”项精制后的多糖23 0mg,溶解并稀释至100ml ,摇匀 ,吸取2 0ml ,加入5 %苯酚溶液1 0ml ,再垂直加入5 0ml浓硫酸 ,静置5min ,振摇 ,置沸水中保温15min ,冷却 ,在490nm波长处测吸收度。重复4次。从回归方程中求出供试液中葡萄糖含量 ,按下式计算换算因子 :J=W/C×D。式中 ,W为实际多糖量 ,C为供试液中葡萄糖量 ,D为稀释因子400。由上式测得J为4 306g(n=10 ,RSD=0 011 % )2 5样品溶液的制备与测定精密称取不同产地长叶榧种子粉末100mg ,置于100ml平底烧瓶中 ,加入80 %乙醇50ml ,回流1h ,滤过 ,用蒸馏水洗涤4次 ,每次5ml ,转移滤液于100ml容量瓶中 ,冷却 ,定容。精密吸取2 0ml ,置于具塞试管中 ,按“2 3”项同法操作 ,测定吸收度 ,按下式计算多糖含量 :含量 (% )= (C×D×J)/W×100 %。式中 ,C为供试液中葡萄糖含量 (mg) ,D为供试样品的稀释因子(400) ,J为换算因子 (4 306) ,W为供试品重量 (mg)。2 6样品液的高效毛细管电泳 (HPCE)法测定按“1 4”项所述电泳条件进行测定。3结果3 1长叶榧种子多糖含量测定长叶榧种子多糖含量测定结果详见表1 ;多糖加样回收率为98 3 % ,RSD=2 31 % (n=5)。表1不同产地长叶榧种子多糖含量测定结果 (n=3)Tab1Determinationresultsofcontentsof polysaccha ridesoftheT jackiiseedfromdifferentorigins (n=3)样品多糖含量 (% )平均值样品A6.59样品B6.526.56样品C6.573 2长叶榧种子多糖HPCE图谱不同产地长叶榧种子所含多糖的HPCE图谱基本一致 ,详见图1。由图1可见 ,长叶榧子中主要含2种多糖 ,其迁移时间分别约为3 33、3 52min。4讨论虽有文献提及榧子中含有多糖 ,但未见有关榧属植物种子多糖含量测定的报道。因此 ,笔者首次对不同产地长叶榧种子中的多糖进行了含量测定并进行了HPCE图谱分析。在本研究中 ,笔者发现长叶榧种子多糖含量较高且多糖组成较简单 ,由此可为一步提取、分离长叶榧种子多糖并进行相关药理活性研究提供科学依据。长叶榧种子中多 糖的含量测定及高效毛细管电泳指纹图谱分析@谢立$广州市胸科医院药剂科!广州市510095
@陈振德$深圳市人民医院药学部!深圳市518020
@许重远$南方医科大学南方医院!广州市510515长叶榧;;种子;;多糖;;含量;;高效 毛细管电泳;;指纹图谱目的:测定不同产地长叶榧种子中多糖含量并建立其高效毛细管电泳指纹 图谱。方法:用酚-硫酸比色法测定多糖含量并对多糖进行高效毛细管电泳指纹图谱分析。结果:长叶榧种子中多糖含量为6.56% ,平均回收率为98.3 % ,RSD=2.31 % (n=5) ;长叶榧种子中主要含2种多糖。结论:3产地的长叶榧子中多糖含量及组成无明显差异。<1>陈 振德中国榧属植物资源、化学及其药理的研究(博士论文)
上海:上海第二军医大学药学院1998
<2>陈振德,郑汉臣,全山丛,等榧属植物的研究进展国外医药-植物药分册,1996,11(4):150
<3>李元宏,涂自良,陈吉炎中药材标准指纹图谱制订与GAP实施中国药房,2003,14(11):697
<4>许重远,陈振德,晏媛,等中药狗脊多糖的含量测定及高效毛细管电泳指纹图谱分析中药材,2004,27(1):22国家自然科学基金资助项目 (39970893) ;深圳市科技基金资助项目 (200204077)测定及高效毛细管电泳指纹图谱分析@谢立$广州市胸科医院药剂科!广州市510095
@陈振德$深圳市人民医院药学部!深圳市518020
@许重远$南方医科大学南方医院!广州市510515长叶榧;;种子;;多糖;;含量;;高效 毛细管电泳;;指纹图谱目的:测定不同产地长叶榧种子中多糖含量并建立其高效毛细管电泳指纹 图谱。方法:用酚-硫酸比色法测定多糖含量并对多糖进行高效毛细管电泳指纹图谱分析。结果:长叶榧种子中多糖含量为6.56% ,平均回收率为98.3 % ,RSD=2.31 % (n=5) ;长叶榧种子中主要含2种多糖。结论:3产地的长叶榧子中多糖含量及组成无明显差异。<1>陈 振德中国榧属植物资源、化学及其药理的研究(博士论文)上海:上海第二军医大学药学院1998
<2>陈振德,郑汉臣,全山丛,等榧属植物的研究进展国外医药-植物药分册,1996,11(4):150
<3>李元宏,涂自良,陈吉炎中药材标准指纹图谱制订与GAP实施中国药房,2003,14(11):697
<4>许重远,陈振德,晏媛,等中药狗脊多糖的含量测定及高效毛细管电泳指纹图谱分析中药材,2004,27(1):22国家自然科学基金资助项目 (39970893) ;深圳市科技基金资助项目 (200204077)
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