目前用于溶栓活性体外检测的方法主要有凝块溶解法、底物法和琼脂纤维蛋白平板法<1～ 3> ,其中琼脂纤维蛋白平板法最为常用。但常规的琼脂纤维蛋白平板须严格控制纤维蛋白原与琼脂的混合温度 ,且不易制备厚度均一的薄层平板 ,从而影响实验的精确度和重现性 ,不适合溶栓活性的高通量精确定量分析。本实验在常规琼脂纤维蛋白平板法的基础上 ,用聚丙烯酰胺代替琼脂作载体 ,用平板电泳制胶模具代替玻璃或塑料平皿 ,制作能严格控制厚度、均匀的薄层聚丙烯酰胺纤维蛋白胶板 ,并用蛋白染色法指示纤维蛋白降解情况 ,建立了一种高灵敏度、高通量的用于溶栓活性定性检测和精确定量分析的薄层聚丙烯酰胺纤维蛋白胶板法。1 材料与方法1 1 材料蚓激酶 (江中制药公司 ) ;牛血纤维蛋白原、凝血酶、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、过硫酸铵、四甲基乙二胺 (TEMED ,Sigma公司 ) ;考马斯亮蓝R2 5 0 (Fluka公司 ) ;其他试剂为国产分析纯。平板电泳制胶模具、薄层聚丙烯酰胺支持膜(GelBondPAGfilm ,Pharmacia公司 ) ;扫描仪ScanMaker 4 (Microtek公司 )。1 2 方法1 2 1 储存溶液配制 用磷酸缓冲液 (0 1mol·L- 1,pH 7 4 ) <4 > 分别配制 10mg·mL- 1的纤维蛋白原、10U·mL- 1凝血酶和 10mg·mL- 1蚓激酶母液 ,分装后 - 2 0℃保存 ,临用前室温融化后按比例稀释 ,一般情况下 1mg的纤维蛋白原需要 1U凝血酶。1 2 2 薄层聚丙烯酰胺纤维蛋白胶板的制备 参考文献<5> 方法制备薄层聚丙烯酰胺纤维蛋白胶板。在无垫片的玻璃板上加 1mL水 ,用滚筒将聚丙烯酰胺支持膜压在玻璃板上 ,将带垫片 (0 4 5mm)的玻璃板放在膜上 ,用夹子夹紧两块玻璃板 ,水平放置。将纤维蛋白原、凝血酶和缓冲液按比例混合 ,搅拌成无可见纤维蛋白聚集的乳白色悬浊液。再按比例依次加入丙烯酰胺、TEMED和过硫酸铵快速混匀后 ,缓慢地加入支持膜与带垫片的玻璃板之间。室温静置 ,待丙烯酰胺聚合成胶后 ,移开玻璃板 ,得到黏在膜上厚度为 0 4 5mm均匀的聚丙烯酰胺纤维蛋白胶板。为提高灵敏度与重现性 ,对制作胶板的丙烯酰胺和纤维蛋白原浓度进行优化选择研究。1 2 3 丙烯酰胺和纤维蛋白原浓度优化 制作含纤维蛋白原 0 5mg·mL- 1和丙烯酰胺分别为 5 % ,10 %和 15 %的薄层聚丙烯酰胺纤维蛋白胶板 ,配制浓度为 10 ,5 ,1,5× 10 - 1,1× 10 - 1,5× 10 - 2 ,1×10 - 2 ,5× 10 - 3,1× 10 - 3,5× 10 - 4,1× 10 - 4,5× 10 - 5,1× 10 - 5,5× 10 - 6 ,1× 10 - 6 mg·mL- 1蚓激酶溶液 ,直接点样 5 μL ,温育后用考马斯亮蓝染色 ,观察丙烯酰胺浓度对结果的影响。为确定纤维蛋白原浓度的影响 ,制作含 10 %的丙烯酰胺和纤维蛋白原浓度分别为 0 0 1,0 0 5 ,0 1,0 5 ,1 0 ,1 5 ,2 0mg·mL- 1的聚丙烯酰胺纤维蛋白胶板 ,用几种浓度的蚓激酶溶液各 5 μL点样 ,温育后考马斯亮蓝染色。1 2 4 加样与染色方法 将滤纸用打孔器打成直径 6mm的圆形滤纸片 ,间隔 2cm放置在胶板上 ,然后在滤纸上加样品 ,另外采取直接加样 ,将样品直接点在胶板上。按“1 2 2”项下制作薄层聚丙烯酰胺纤维蛋白胶板 ,加样后 ,37℃保湿温育 8～ 12h后 ,用蒸馏水冲洗 3～ 5次 ,分别用考马斯亮蓝或硝酸银染色观察。另制作含 0 2 %考马斯亮蓝的蓝色聚丙烯酰胺纤维蛋白胶板 ,加样温育后直接脱色观察 ,与上述染色方法比较。1 2 5 溶栓活性的定量分析 制作含纤维蛋白原0 5mg·mL- 1和 10 %丙烯酰胺的薄层聚丙烯酰胺纤维蛋白胶板 ,取不同浓度的蚓激酶溶液点样 ,温育后染色 ,参照文献<3> 方法测量透明圈两垂直直径 ,以透明圈两垂直直径算术平均值平方的对数为纵坐标 ,以蚓激酶溶液浓度的对数为横坐标 ,用软件Ori gin5 0作曲线 ,进行回归分析 ,计算r值。为确定本方法所测透明圈直径算术平均值平方的对数与蚓激酶浓度对数的线性范围 ,分别对 5× 10 - 3～ 10 ,1×10 - 2 ～ 10 ,5× 10 - 3～ 5 ,1× 10 - 2 ～ 5mg·mL- 14个梯度蚓激酶浓度对数及其所对应的透明圈直径平方对数回归分析 ,计算r值。在 5块不同批次的薄层聚丙烯酰胺纤维蛋白胶板上 ,用 1mg·mL- 1的蚓激酶溶液各点样 1次 ,测量5个透明圈两垂直直径 ,计算RSD值。2 结果与讨论2 1 胶板制备以聚丙烯酰胺代替琼脂糖作载体 ,使用薄层平板电泳灌胶模具 ,可在常温完成厚度均一的薄层聚丙烯酰胺纤维蛋白胶板的制备。胶板黏附在聚丙烯酰胺支持膜上 ,可以在 4℃湿盒内存放 1周 ,使用前再根据待测样品多少剪取适当大小的胶板。纤维蛋白降解情况利用考马斯亮蓝作指示剂观察 ,结果清晰明了 ,提高了检测的灵敏度。我们采用薄层聚丙烯酰胺纤维蛋白胶板法最低可观察到 2 5ng蚓激酶产生的溶栓透明圈 ,而采用常规琼脂纤维蛋白平板法 ,最低只能观察到 2 0 μg蚓激酶产生的透明圈 ,薄层聚丙烯酰胺纤维蛋白胶板法比琼脂纤维蛋白平板法的灵敏度提高了近千倍。在常规的纤维蛋白平板法中 ,样品的蛋白含量一般不影响透明圈产生 ,但本方法中可能会因为样品总蛋白染色斑完全覆盖透明圈 ,呈现假阴性结果。本实验室曾准备用此法检测口饲蚓激酶后试验动物血液纤溶活性的变化 ,但因为不能排除血液蛋白的干扰而失败。如何排除样品蛋白的染色干扰是有待研究的问题。2 .2 方法优化使用含 0 5mg·mL- 1纤维蛋白原和不同浓度丙烯酰胺制成的胶板 ,测定了不同浓度蚓激酶的作用 ,结果显示含 5 %丙烯酰胺胶板上的透明圈边缘模糊 ,含 10 %和 15 %的边缘较清晰 ,而相同浓度蚓激酶产生的透明圈随着丙烯酰胺浓度增大而减小。测量并计算透明圈两垂直直径平均值结果见表 1,由表 1可知透明圈大小与蚓激酶浓度呈正相关。表 1 蚓激酶在聚丙烯酰胺薄层纤维蛋白胶板上形成透明圈两垂直直径平均值Tab 1 Averageverticaldiametersoftransparentspots lysedbylumbrokinaseonthethinpolyalrylamidefibrinplateassay蚓激酶浓度/mg·mL-1垂直直径长度平均值 /mm5%丙烯酰胺 10 %丙烯酰胺 15%丙烯酰胺10 14 519 97 8 6 1513 189 587 84112 6 2 7 6 87 345× 10 - 1 11 387 136 521× 10 - 1 10 185 74 4 935× 10 - 2 9 72 5 17 4 4 11× 10 - 2 8 0 7 4 193 915× 10 - 37 16 3 4 53 18注 :胶板含 0 5mg·mL- 1 纤维蛋白原Note :platecontained 0 5mg·mL- 1 fibrin使用不同浓度的纤维蛋白原制备胶板的结果表明 ,纤维蛋白原浓度在 0 1～ 1mg·mL- 1之间对透明圈的产生及观察效果影响不大。纤维蛋白原浓度低于 0 1mg·mL- 1时 ,背景着色太浅 ,透明圈反差小 ,不易观察 ;高于 1mg·mL- 1时 ,纤维蛋白不易完全分散 ,染色后胶板呈现背景染色不均匀的现象 ,影响观察效果 ,且纤维蛋白原用量大 ,增加了成本。根据实验结果确定 0 5mg·mL- 1纤维蛋白原和10 %丙烯酰胺为制作薄层聚丙烯酰胺纤维蛋白胶板的适宜条件。2 3 加样与染色方式比较直径 6mm的圆形滤纸片上可加 10～ 2 0 μL样品 ,直接在胶板上加样时可加 0 5～ 5 μL样品。在胶板上直接加 5 μL样品时样品溶液直径在 3 5mm左右。常规的琼脂纤维蛋白平板一般采用打孔加样 ,本胶板无法打孔 ,但样品量较大时用滤纸加样 ,样品微量时直接将样品点加在胶板上。在进行大规模溶栓活性筛选鉴定和溶栓活性的跟踪检测时 ,直接点加样品在胶板上 ,两点间隔 1cm ,一块 5cm× 10cm的胶板可点 14 0个样品 ,这样既可节省样品又提高了通量。薄层聚丙烯酰胺纤维蛋白胶板经考马斯亮蓝染色后 ,背景呈蓝色 ,纤维蛋白被蚓激酶降解后在点样处形成透明圈 ,最低可观察到蚓激酶浓度为 5×10 - 3mg·mL- 1(即 2 5ng蚓激酶 )产生的透明圈。当蚓激酶浓度高于 0 5mg·mL- 1即点样处酶蛋白量大于 2 5 μg时 ,酶蛋白本身会染上色形成蓝色的加样斑 ,但不影响结果判定。用硝酸银染色观察时 ,胶板背景易呈黄色 ,酶蛋白本底着色清晰 ,纤维蛋白溶解透明圈不明显。制作含考马斯亮蓝的蓝色胶板 ,结果整个胶板呈蓝色 ,蚓激酶点样处有透明圈产生 ,且透明圈界限清晰 ,但灵敏度不高 ,只能观察到 1× 10 - 1mg·mL- 1以上浓度蚓激酶所产生的透明圈。2 4 溶栓活性的定量分析以透明圈两垂直直径的算术平均值平方的对数为纵坐标 ,以蚓激酶溶液浓度的对数为横坐标 ,用软件Origin5 0作曲线 ,进行回归分析 ,可知蚓激酶浓度在 0 0 1～ 5mg·mL- 1之间时成良好的线性关系 ,Y=0 2 6 6X + 1 7778,r =0 9997。重复性试验中测得
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