血栓栓塞症是作为老年人的一种常见突发症,近年来患者人数明显上升,年龄范围明显扩大。目前临 床应用最多的药物是链激酶和尿激酶,但这2种药物在体内的半衰期短,必须大剂量长期用药,且 有易产生全身性出血的倾向。因此开发副作用低、可以大规模生产、成本低廉、使用安全的新型血 栓溶酶是生化制药工业目前亟待解决的问题。豆豉激酶作为一种理想的预防和治疗血栓栓塞的生化 药物,具有巨大的市场潜力。纳豆是大豆经过蒸煮后接上纳豆芽孢杆菌(Bacillusnat tosawamura.natto),经发酵制成的。1987年日本的须见洋行博士首次从纳 豆中提取纯化出一种具有溶解交联纤维蛋白功能的纳豆激酶(nattokinase,简写NK ),该酶能显著溶解体内外血栓,明显缩短优球蛋白的溶解时间。近几年日本很多学者对纳豆芽孢 杆菌的菌种选育、发酵工艺、提取纯化方法、纳豆激酶的生理生化性质、基因克隆、DNA序列以 及药理学功能等进行了深入的研究<1-3>。我国目前有关纳豆和纳豆激酶的报道已有数十篇, 从菌种的引进筛选、发酵工艺、基因克隆和表达等多方面进行研究,取得了一定的研究进展<4- 5>。豆豉发酵加工处理对于提高豆豉的自身营养与活性成分,是一种十分有效的工艺技术条件, 如豆豉加工使糖苷型大豆异黄酮在β-葡萄糖苷酶的作用下部分转化为游离型大豆异黄酮,使活性 更高的游离型大豆异黄酮的含量明显提高眼6演。我国豆豉可分为霉菌型和细菌型2大类,山东特 产药食两用的临沂豆豉就属于细菌型豆豉。目前我国对纳豆的孪生姐妹、中国的细菌型豆豉激酶的 溶解血栓和降解交联纤维蛋白的作用机理研究甚少。在我们的初步研究中发现,临沂豆豉中也富含 溶解纤维蛋白的成分。1材料与方法1.1材料豆豉:春天自然发酵后未经洗曲所得干豆豉(2号 样品);成品八宝豆豉(3号样品)。均由山东临沂唯一斋酱园公司提供。1.2主要试剂牛血纤 维蛋白原、凝血酶、尿激酶:中国药品生物制品检定所出品。1.3主要仪器SKP-01型恒温 培养箱:湖北黄石市医疗器械厂;HY-2型调速多用振荡器:江苏中大仪器厂;3K30型高速 离心机:德国SIQMA公司。1.4方法1.4.1纤维蛋白平板的制备取φ9cm的无菌培养 皿1个,置于水平操作台内,向其中各加入17mL纤维蛋白原溶液(25mg/mL)和0.5 mL凝血酶液(30BP/mL),小心振荡使之混匀,然后静置室温过夜,制得纤维蛋白平板。 一般现用现配,以防污染。1.4.2豆豉溶栓活性成分的粗提取分别取样品100g,各加生理 盐水500mL,常温下浸提,间隔30min振荡1次。24h后将提取液于高速离心机中12 000r/min,离心5min,取上清液待用。1.4.3豆豉溶栓酶活性测定(采用纤维蛋 白平板法)利用制备好的纤维蛋白平板,用微量注射器分别吸取尿激酶溶液(100U/mL)及 样品溶液各10μL,滴在同一平板的不同位置上,加盖,放置于37℃恒温培养箱中,每隔1h 观察溶栓情况。8h后取出进行照相、用游标卡尺测量溶圈的直径,算出溶圈积。1.4.4温度 对豆豉溶栓酶稳定性的影响溶栓酶的粗提取液置不同温度的水浴中保温,每隔30min取样测定 残余酶活。2结果与讨论2.12个豆豉样品溶栓酶的粗提取液均具有溶栓活性以尿激酶(1号) 、生理盐水(C)作对照,分别测溶圈,进而可以排除2、3号样品中生理盐水的溶栓活性,具有 溶栓活性的物质应该是从豆豉中提取的成分。2.22个豆豉样品的粗提取液溶栓活性的强弱有所 不同由附表也可以发现,2号样品(春天自然发酵后未经洗曲晒干)的粗提取液溶栓活性最强;3 号样品(成品八宝豆豉)的粗提取液溶栓活性最低。分析原因:在豆豉的制作工艺中为防止大量蛋 白酶在豆豉的后发酵过程中造成水解过分,需进行洗曲处理。在洗曲工序中可能损失了部分溶栓活 性成分。另外由于临沂八宝豆豉是水豆豉(湿豆豉),成品中有许多辅料(如紫苏、茄子、南酒、 甜杏仁等),造成3号样品的粗提取液溶栓效果比2号样品低。2.3利用2号样品的粗提取液进 行了初步耐热实验实验结果表明,该酶在25℃~45℃范围内酶活保持相对稳定。随着温度升高 ,酶迅速失活。超过60℃保温2h,溶栓活性完全丧失,在90℃的水浴中加热10min也可 使粗提取液的溶栓活性丧失,说明该酶对高温较为敏感。温度对豆豉溶栓活性成分的详细影响需进 一步实验研究。3结论我国传统细菌型豆豉——临沂豆豉中也含有溶栓活性成分的物质。春天自然 发酵后未经洗曲的临沂细菌型豆豉的粗提取液溶栓活性最强。所以在利用细菌型豆豉制作功能性食 品的研究中应注意是否要进行洗曲工序。豆豉粗提取液中的溶栓活性成分不耐热。在加工豆豉时应注意尽可能保持较低的加工温度。细菌型豆豉中溶栓活性成分的初步研究@宋永生$济南大学!山东济南250002
@张炳文$济南大学!山东济南250002细菌型豆豉;;溶栓活性利用纤维蛋白平板法研究发现 ,我国传统的细菌型豆豉——临沂豆豉中含有与日本纳豆相似的溶栓活性成分。研究发现春天自然 发酵后未经洗曲的临沂细菌型豆豉的粗酶提取液溶栓活性最强;但该成分不耐热,在加工中应尽量 保持较低温度。该实验为利用豆豉开发新型溶栓药物及保健食品提供了参考依据。<1>须见洋行 ,马场健史,岸丁明.纳豆中のづロウキナゼ活性化酵素と血栓溶解能
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<2>CHAVAKIS T,TOBIN A,PIXLEY I, etal.A novel antithronbotic role for high molecular weight kiniogen as inhibitor of plas minogen activator inhibitor function.BiolChem,2002,277(36):32677-32682.
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<4>谢秋玲,孙奋勇,等.纳豆激酶原基因的克隆及表达.华南理工大学学报(自然科学版),2002,30(6):19-21.
<5>杨艳燕,李顺意,等.纳豆杆菌的筛选和纳豆激酶的初步分离.沈阳医科大学学报,2001,18(6):436-438.
<6>张炳文,宋永生,等.发酵处理对大豆制品中异黄酮含量与组分影响的研究.食品与发酵工业,2002,28(7):6-9.
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