主要组织相容性复合体(MHC)Ⅱ类分子是高 度多态性的异源二聚体,由α和β链组成。MHCII 类分子有递呈外原抗原肽分子给CD4+T淋巴细胞 的作用,对于机体的免疫功能也非常重要<1,2>。
牛膝多糖(ABPS)是从牛膝根中分离提取得到 的一种小分子水溶性的多糖化合物,其化学结构已 经明确,糖基组成为果糖和葡萄糖,糖基摩尔比为 8.7∶1.0,平均分子量为1400。牛膝多糖能上调胸 腔巨噬细胞内乳酸脱氢酶和酸性磷酸酶活性,并能 显著诱导胸腔巨噬细胞表达肿瘤坏死因子 α和白 细胞介素 6,而且对肿瘤坏死因子 α的诱导表达具 有显著的剂量效应。牛膝多糖对巨噬细胞具有激活 作用<3>。 笔者应用RT PCR技术检测牛膝多糖诱导单 核细胞HLA DRα表面分子核酸变化并且对PCR 产物进行测序鉴定,发现牛膝多糖能上调单核细胞 HLA DRαmRNA的表达,提示牛膝多糖可能有增 强单核细胞抗原呈递功能。 1 材料与方法 1.1 外周血单核细胞的分离及鉴定<4> 先用密度梯度法分离得单个核细胞(PBMC), 再用贴壁法分离得单核细胞,用适量含1/5000 EDTA的无钙镁Hanks液消化细胞15～30min (37℃),用吸管吹打分离细胞,离心250×g, 10min,去上清,收集细胞。贴壁得到的单核细胞用 PBS洗涤一次,离心,去上清加100μlPBS,再加 10μl荧光标记抗体CD14(晶美)染色15min(暗处) 后,再加2mlPBS,混匀,流式细胞检测。荧光标记 细胞必须在4h内检测。 1.2 牛膝多糖(ABPS)培养液配制 准确称取ABPS(我院中药研究所提供)1.0溶 解于适量RPMI1640细胞培养液里,用5% NaHCO3调pH至7.2～7.4,定容至100ml,蔡氏滤 器0.22μm微米滤膜无菌过滤,配制成含20%小牛 血清的10mg/mlABPS RPMI1640细胞培养液,再 用含20%小牛血清的RPMI1640将10mg/ml ABPS RPMI1640细胞培养液稀释成ABPS浓度为 0.321,1.250,5.00mg/ml的ABPS RPMI1640细 胞培养液。 1.3 单核细胞的诱导培养 用RPMI 1640将上述所得单核细胞配制成 0.8ml细胞悬液,分别接种24孔培养板的四个孔中, 每孔0.20ml,使得每孔细胞数约为2×105个单核细 胞,再加细胞培养液0.5ml,37℃、5%CO2培养。分别 以两个不同的条件培养细胞:(1)设置时间为8h,不 同ABPS浓度为0.00、0.321、1.250、5.00mg/ml培养
单核细胞。(2)设置ABPS浓度为1.25mg/ml,不同 时间为0,2,8,12h培养单核细胞。按照不同的要求 培养细胞后,去除上清液,用细胞洗液(EDTA无钙镁 Hanks液)洗脱细胞,收集细胞备用。 1.4 RT PCR检测单核细胞HLA DRαmRNA 表达 HLA DRα的引物序列:上游为5 CTGACTCC CAAAAGAGCGCCC 3 (位于HLA DRα基因第一外显 子);下游为5 TGCTTGAGAAGAGGCTCATCC 3 (位于HLA DRα基因第三外显子),扩增片段大 小为635bp。作为内对照的β actin引物序列:上游 引物5 TTCCTGGGCATGGAGTCCT 3 ;下游引 物5 TGATCTTCATTGTGCTGGGTG 3 ,β actin产物大小为187bp。优化条件进行RT PCR 检测单核细胞HLA DRαmRNA表达。 1.5 β actin作为内参照半定量分析 用琼脂糖凝胶电泳分析系统分析PCR产物电 泳条带,HLA DRα条带的峰值除以β actin条带的 峰值作为评价不同条件ABPS诱导单核细胞HLA DRαmRNA表达水平。 1.6 HLA DRαPCR产物的验证 HLA DRαPCR产物送上海生工测序。在 NCBI上,引物和产物序列分别进行BLAST,评价 引物和产物序列的同源性。 1.7 数理统计分析 数据采用SPSS10.0统计软件分析处理,计量 资料以x±s表示.P<0.05被认为有意义。 2 结果 2.1 外周血分离获得的单核细胞 新鲜分离获得的单核细胞。用流式细胞术检 测。CD14+细胞在分离的PBMC中占12.0%, CD14+细胞在PBMC细胞贴壁后分离得到单核细 胞中占83.1%。 2.2 同一时间(8h)不同ABPS浓度PCR产物琼脂 糖凝胶电泳分析 在实验条件相同的情况下,设置了内参照,空白 对照组PCR产物明显低于ABPS诱导组,并有剂量 效应关系。 2.3 同一浓度ABPS(1.250mg/ml)不同时间PCR 产物琼脂糖凝胶电泳分析 在实验条件相同的情况下,设置了内参照,空白 对照组PCR产物明显低于ABPS诱导组,并有时间 效应关系。 2.4 β actin内参照半定量分析 在电泳条带的峰值图中,a为同一时间不同浓 度ABPS条带峰值图,b为同一浓度ABPS不同时 间条带峰值图。表一为相对应HLA DRα条带的峰 值除以β actin条带的峰值的比值(R)。如图1。 2.5 HLA DRαPCR产物测序结果 PCR产物测得序列为:ataagtggagtccctgtgct aggatttttcatcatagctgtgctgatgagcgctcaggaa tcatgggctatcaaagaagaacatgtgatcatccaggccg agttctatctgaatcctgaccaatcaggcgagtttatgtt tgactttgatggtgatgagattttccatgtggatatggca aagaaggagacggtctggcggcttgaagaatttggacgat ttgccagctttgaggctcaaggtgcattggccaacatagc tgtggacaaagccaacctggaaatcatgacaaagcgctcc aactatactccgatcaccaatgtacctccagaggtaactg tgctcacgaacagccctgtggaactgagagagcccaacgt cctcatctgtttcatcgacaagttcaccccaccagtggtc aatgtcacgtggcttcgaaatggaaaacctgtcaccacag gagtgtcagagacagtcttcctgcccagggaagaccacct tttccgcaagttccactatctccccttcctgccctcaact gaggacgtttacgactgcagggtggagcactggggcttgg atgagcctcttctcaagcactgggagtttgatgctccaag ccctctcccagagac。分别将引物和产物序列在NCBI 上进行BLAST,它们均与NM_019111同
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