0 引言纤维蛋白溶解酶活性(纤溶酶活性)体外检测是筛选和评价纤溶酶类溶栓药物的关键技术. 目前用于纤溶酶活性体外检测方法主要有琼脂纤维蛋白平板法、发色底物法、酶联纤维蛋白溶解法 和凝块溶解时间法等.这些方法各有其优点和应用范围,但每种方法也都有一定的局限性,从而限 制了其广泛的应用.为大规模筛选纤维蛋白溶解酶类物质,开发新的纤溶酶类溶栓药物,本研究已 建立了薄层聚丙烯酰胺纤维蛋白平板法<1>.该法是在琼脂纤维蛋白平板的基础上,用聚丙烯酰 胺代替琼脂作载体,用平板电泳制胶模具代替玻璃或塑料平皿,制作能严格控制厚度、均匀的薄层 聚丙烯酰胺纤维蛋白平板,并用蛋白染色法指示纤维蛋白溶解情况.这种方法具有灵敏度高、通量 大、重现性好、易于标准化、样品用量少、设备简单、操作简便及可定量分析等优点,适用于纤溶 酶类药物的初筛、跟踪检测活性成分和测量相对纤溶酶活性等.为了验证薄层聚丙烯酰胺纤维蛋白 平板法体外检测纤溶酶活性的准确性和可靠性,本文运用该法对6种市售心血管药物进行了纤溶酶 活性的体外检测研究.1 材料与方法1.1 材料 供试药品:活血通脉胶囊(山西省忻州市云 中制药厂);血府逐瘀胶囊(天津市第五中药厂);血栓通注射液(内蒙古康源药业有限公司); 血塞通注射液(昆明制药集团股份有限公司);丹参注射液(三九医药股份有限公司);蚓激酶( 江中制药).试剂:牛血纤维蛋白原、凝血酶、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、过硫酸铵、TEME D(Sigma公司);考马斯亮蓝R250(Fluka公司);其他试剂为国产分析纯.仪器 :平板电泳制胶模具、薄层聚丙烯酰胺支持膜(Pharmacia公司).1.2 方法1.2 .1 样品溶液配制 用PBS配制10g/L的蚓激酶溶液,再10-1、10-2倍稀释,即 制成10、1、0.1g/L3个浓度的蚓激酶溶液.取血府逐瘀胶囊、活血通脉胶囊一次剂量的 1/10,分别用PBS1mL配成溶液,并稀释至10-1、10-2,制成剂量/10、剂量 /100、剂量/1000这3个浓度的样品溶液.以血栓通注射液、血塞通注射液、丹参注射液 原液为溶液,并分别用PBS稀释至10-1、10-2,即制成原注射液、原注射液/10、原 注射液/100这3个浓度的样品溶液.JournalofSichuanNormalUni versity(NaturalScience)Vol.28,No.2 1.2.2 薄层 聚丙烯酰胺纤维蛋白平板的制备 用PBS配制10g/L的纤维蛋白原和10U/mL凝血酶母 液,分装后-20℃保存,临用前室温融化.参考制备薄层等电聚焦平板的方法<2>,制作含纤 维蛋白0.5g/L和10%(质量体积比)聚丙烯酰胺的薄层聚丙烯酰胺纤维蛋白平板.具体操 作为:在无垫片的玻璃板上加1mL水,用滚筒将聚丙烯酰胺支持膜压在玻璃板上,将带垫片(0 .45mm)的玻璃板放在膜上,用夹子夹紧两块玻璃板,水平放置.将纤维蛋白原、凝血酶和P BS按比例混合,搅拌成无可见纤维蛋白聚集的乳白色悬浊液,按比例依次加入丙烯酰胺、TEM ED、过硫酸铵快速混匀后,缓慢均匀地加入到支持膜与带垫片的玻璃板之间.室温静置,待丙烯 酰胺聚合成胶后,移开玻璃板,得到粘在支持膜上0.45mm厚度均匀的薄层聚丙烯酰胺纤维蛋 白平板.1.2.3 样品的检测 分别取各样品溶液5×10-6L每间隔2cm点在平板上, 37℃保湿温育8～12h后,用蒸馏水冲洗3～5次,考马斯亮蓝染色,观察分析透明圈的产生 .2 实验结果和讨论薄层聚丙烯酰胺纤维蛋白平板经考马斯亮蓝染色后,整个平板呈蓝色,有纤 溶酶活性的样品溶解纤维蛋白后,在加样处形成透明圈(如图1中1～5号样品),根据是否形成 透明圈和透明圈的大小来判断样品纤溶酶活性的有无及强弱.6种药物纤溶酶活性体外检测结果见 图1.1～18依次为:蚓激酶、血府逐瘀胶囊、活血通脉胶囊、血栓通注射液、血塞通注射液、 丹参注射液积压浓度样品.注:1,2号样品形成的透明圈中蓝色斑点为高浓度蚓激酶本底蛋白的 染色斑 由图1可知,3个浓度的蚓激酶溶液在薄层聚丙烯酰胺纤维蛋白平板上都形成了明显的 透明圈,0.1、1和10g/L样品溶液形成的透明圈直径依次递增,表明蚓激酶具有体外纤溶 酶活性,可体外溶解纤维蛋白.蚓激酶是从蚯蚓中提取的一类具有纤溶酶活性的酶类.文<2>研 究表明蚓激酶为多种酶制剂,体内及体外均可溶解血栓,它能直接溶解纤维蛋白,并具有纤溶酶酶 原激活剂的作用.剂量/10和剂量/100的血府逐瘀胶囊样品溶液在薄层聚丙烯酰胺纤维蛋白 平板上也形成了透明圈,表明一定浓度的血府逐瘀胶囊能够体外溶解纤维蛋白.现代药理与临床研 究表明血府逐瘀胶囊具有改善血液流变性,降低全血黏度及红细胞、血小板聚集,减少红细胞压积 ,降低纤维蛋白原水平和胆固醇水平等作用<3>.本实验结果为一定浓度的血府逐瘀胶囊在体外 具有纤溶酶活性,表明该胶囊中含有纤维蛋白溶解酶类物质.活血通脉胶囊主要成分是水蛭素,水 蛭素是目前所知最强的凝血酶特效抑制剂,它能阻止纤维蛋白原凝固,阻止凝血酶催化的血瘀反应 ,能抑制凝血酶与血小板结合.因此活血通脉胶囊主要具有防栓抗凝而无纤溶酶作用<4>.本实 验中,活血通脉胶囊在薄层聚丙烯酰胺纤维蛋白平板不形成透明圈,也说明其体外没有纤溶酶作用 .由图1可知,血栓通和血塞通注射液都没有纤溶酶活性,不能体外溶解纤维蛋白.这是因为血栓 922通和血塞通注射液主要活性成分是三七总皂甙,无纤溶酶活性.文<5>表明血栓通具有扩 张血管和改善血液循环,降低外周血管阻力和抗血栓抗血凝的作用.血塞通注射液能显著降低全血 粘度、血浆粘度及血球压积,降低红细胞脆性,抑制血小板凝集,同时有促进纤溶酶的作用<6> .本实验结果表明,丹参注射液没有纤溶酶活性,不能体外溶解纤维蛋白.此结果与文<7>关于 丹参注射液可降低全血粘度、血浆粘度,但对血液纤维蛋白原含量无明显影响的报道相符.3 结 语本实验用薄层聚丙烯酰胺纤维蛋白平板体外检测6种市售心血管药物的纤溶酶活性,其结果与相 关文献报道的该药物药理作用相符,表明薄层聚丙烯酰胺纤维蛋白平板法能够准确、可靠地检测纤 溶酶活性,是一种值得推广的纤溶酶活性体外检测方法.薄层聚丙烯酰胺纤维蛋白平板法对纤溶酶活性的体外检测@赵明$四川师范大学生命科学学院!四川成都610068中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室,北京 1 0 0 0 94
@潘映红$中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室!北京100094
@冯定胜$四川师范大学生命科学学院!四川成都610068
@王一丁$四川师范大学生命科学学院!四川成都610068
@郭宝林$中国医学科学院和中国协和医科大学药用植物研究所!北京100094
@严伟$四川师范大学生命科学学院!四川成都610068薄层聚丙烯酰胺纤维蛋白平板法;;心 血管药物;;纤溶酶活性;;体外检测用薄层聚丙烯酰胺纤维蛋白平板法体外检测了6种市售心血 管药物的纤溶酶活性,结果与所检测药物的相关药理作用相符,表明薄层聚丙烯酰胺纤维蛋白平板 法能够准确、可靠地进行纤溶酶活性的体外检测.<1>郭尧君.蛋白质电泳实验技术
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<7>赵胜利,高建玲,翟丽娜.丹参及黄芪注射液对心脑血管病患者血液流变学的影响.实 用中医杂志,2002,18(6):5.国家重大项目前期研究专项基金(2001cca01 100)资助项目磉?无纤溶酶活性.文<5>表明血栓通具有扩张血管和改善血液循环,降低外 周血管阻力和抗血栓抗血凝的作用.血塞通注射液能显著降低全血粘度、血浆粘度及血球压积,降 低红细胞脆性,抑制血小板凝集,同时有促进纤溶酶的作用<6>.本实验结果表明,丹参注射液 没有纤溶酶活性,不能体外溶解纤维蛋白.此结果与文<7>关于丹参注射液可降低全血粘度、血 浆粘度,但对血液纤维蛋白原含量无明显影响的报道相符.3 结语本实验用薄层聚丙烯酰胺纤维 蛋白平板体外检测6种市售心血管药物的纤溶酶活性,其结果与相关文献报道的该药物药理作用相 符,表明薄层聚丙烯酰胺纤维蛋白平板法能够准确、可靠地检测纤溶酶活性,是一种值得推广的纤 溶酶活性体外检测方法.薄层聚丙烯酰胺纤维蛋白平板法对纤溶酶活性的体外检测@赵明$四川师范大学生命科学学院!四川成都610068中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室,北京 1 0 0 0 94
@潘映红$中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室!北京100094
@冯定胜$四川师范大学生命科学学院!四川成都610068
@王一丁$四川师范大学生命科学学院!四川成都610068
@郭宝林$中国医学科学院和中国协和医科大学药用植物研究所!北京100094
@严伟$四川师范大学生命科学学院!四川成都610
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