白癜风是临床常见皮肤病 ,主要是由于黑素细胞的选择性破坏引起特征性色素脱失斑<1> 。黑素细胞由神经嵴发生 ,经背外侧途径迁移到表皮基底层和毛囊。白癜风皮损恢复时毛囊外毛根鞘处黑素细胞储库中黑素细胞活化、增殖并迁移到皮损处<2 > 。尽管中药治疗白癜风有较好的疗效 ,但其作用机制尚未明了。本研究从古今治疗白癜风方剂中筛选 2味常用中药补骨脂、
白芷 ,对比观察其乙醇提取物对黑素细胞黏附和迁移的影响 ,探讨其作用机制 ,供临床治疗参考。1 试验资料1 1 材料 角质形成细胞无血清培养基 (KC -SFM )购自美国Gibco公司 ;纤维连接蛋白为美国Sigma公司产品 ,4 8孔培养板和Transwell培养板购自德国Costar公司。1 2 黑素细胞培养 黑素细胞培养参考文献 <3>,取临床包皮环切术切除的正常人包皮 ,用消化酶Dispass -Ⅱ消化 ,分离表皮与真皮 ,然后表皮用胰酶消化 ,分离角质形成细胞和黑素细胞 ,用角质形成细胞无血清培养基 (KC -SFM)混合培养黑素细胞和角质形成细胞。用 5 %CO2 ,37℃恒温培养箱培养 72h。用选择性消化法 (0 .0 5 %胰蛋白酶和 0 .0 2 %EDTA)分离黑素细胞 ,培养于KC -SFM。通过形态特点和黑素细胞特异性标志酪氨酸酶相关蛋白 1染色鉴别。1 3 中药提取 中药补骨脂、白芷分别研碎 (过 80网筛 ) ,用70 %乙醇回流提取 3d ,经过滤、低温蒸馏得到稠膏状提取物用二甲基亚砜溶解 ,调整浓度至相当于生药 10g/mL ,- 2 0℃保存备用。试验时分别用KC -SFM溶解 ,滤过 ,终浓度为相当于生药 2 .5 g/L。1 4 黑素细胞黏附测定 4 8孔培养板每孔用含 10 μg纤维连接蛋白的 0 .5mLKC -SFM处理 2h ,然后用PBS洗去未结合的蛋白。黑素细胞分别用不含 (对照组 )和含中药乙醇提取物的KC -SFM培养 3d ,经胰酶消化、热灭活胎牛血清中和胰酶的作用、PBS洗、以 5× 10 7L-1细胞重悬于KC -SFM ,每孔加入 4 0 0 μL ,1.5h后 ,用PBS洗去未黏附的细胞 ,黏附的细胞用胰酶消化然后计数 ,所有步骤至少重复 3次。1 5 黑素细胞迁移测定 方法参考文献 <4 >。取Transwell培养板 ,将培养小室用带 8.0 μm孔径微孔的聚碳酸酯膜分成上下 2室 ,该膜试验前 1d用 5 μg纤维连接蛋白包被 ,经室温过夜晾干。黑素细胞 (2× 10 9L-1)分别加于上室 (聚碳酸酯膜上 ) ,用不含 (对照组 )和含中药补骨脂、白芷的KC -SFM培养 18h ,取出聚碳酸酯膜用甲醇固定 ,苏木素伊红 (HE)染色 ,膜上层 (未迁移到下层 )的黑素细胞用棉拭子擦去 ,高倍镜下随机取 4个高倍视野计数通过 8.0 μm孔径微孔迁移到膜下层的黑素细胞。所有步骤至少重复 3次。1 6 统计分析 用SPSS统计软件对数据进行统计分析 ,所测数据用单因素、单侧Dunnettt检验分析。2 结 果2 1 中药对体外培养黑素细胞黏附的影响 黏附黑素细胞百分数 (percent)为黏附细胞 /总细胞数。对照组 (2 6 .1±2 7) % ,补骨脂组 (37.8± 3.9) % ,白芷组 (33.9± 3.7) %。白芷组与对照组相比有显著性差异 (t=3.6 0 ,P <0 .0 5 ) ;补骨脂组与对照组相比有极显著性差异 (t=5 .13,P <0 .0 1) ;白芷组与补骨脂组相比无显著性差异 (t=1.4 5 ,P =0 .10 )。2 2 中药对体外培养黑素细胞迁移的影响 对照组及补骨脂组、白芷组处理黑素细胞迁移光镜HE染色结果见图 1～ 3。每高倍视野 (× 4 0 )迁移细胞 :对照组 (6 4 .0± 7.6 )个 ,补骨脂组 (10 5 .0± 11.8)个 ,白芷组 (87.7± 10 .3)个。白芷组与对照组相比有显著性差异 (t=3.2 8,P <0 .0 5 ) ,补骨脂组与对照组相比有极显著性差异 (t=3.78,P <0 .0 1)。白芷组与补骨脂组相比有显著性差异 (t=2 .2 1,P =0 .0 3)。图 1 正常对照组黑素细胞的迁移图 2 白芷处理组黑素细胞的迁移3 讨 论曾有研究表明一些中药乙醇提取物通过上调酪氨酸酶活性的作用可促进表皮黑素细胞的合成 ,其与紫外线联合治疗白癜风已在临床应用多年 ,取得了一定疗效<5-7> ,但因斑点状的不协调色素广泛再生影响美容 ,且治疗停止后易于复发使图 3 补骨酯处理组黑素细胞的迁移其在临床广泛应用受到限制<8> 。细胞迁移对胚胎发育、伤口愈合、白细胞吞噬、恶性肿瘤细胞侵袭和转移具有非常重要的意义 ,而毛囊外毛根鞘处黑素细胞储库中黑素细胞迁移到白癜风皮损处是白癜风恢复的关键环节<2 -3 > 。黑素细胞是贴附生长细胞 ,黑素细胞与胞外基质的贴附是黑素细胞增殖的前提。而影响黑素细胞黏附和迁移的因素在白癜风发病和治疗的研究中就显得尤为重要。本研究中笔者选择了 2味常用于治疗白癜风的中药 -
补骨脂、白芷 ,对比检测了其乙醇提取物对黑素细胞迁移和黏附的影响。中药的浓度参照其常用量 10g和正常成人血容量 4 0 0 0mL<9> 设定。结果发现补骨脂、白芷均可诱导黑素细胞黏附和迁移 ,且补骨脂对黑素细胞黏附和迁移的影响均大于白芷。这些研究表明中药可能通过不同的机制发挥治疗作用 ,但具体是中药中所含的某种活性成分起作用还是多种活性成分共同作用 ,中药作用机制如何尚待进一步研究。以期为临床选药和提取中药有效成分提供理论依据补骨脂、白芷对黑素细胞迁移和黏附影响的比较@马慧群$西安交通大学第二医院!陕西西安710004
@冯捷$西安交通大学第二医院!陕西西安710004
@张宪旗$西安交通大学第二医院!陕西西安710004
@牟宽厚$西安交通大学第一医院!陕西西安710061
@刘超$西安交通大学第二医院!陕西西安710004
@牛新武$西安交通大学第二医院!陕西西安710004
@党倩丽$西安交通大学第二医院!陕西西安710004
中药;;黑素细胞;;
迁移;;白癜风目 的 比较中药补骨脂、白芷乙醇提取物对体外培养黑素细胞黏附、迁移的影响。方法 中药补骨脂、白芷分别用70%乙醇提取,正常人黑素细胞来自包皮环切术切取的包皮,用包被纤维粘连蛋白的4 8孔培养板检测黑素细胞黏附,用微孔膜研究黑素细胞迁移。结果 补骨脂、白芷可同时促进黑素细胞黏附和迁移。两者的促黑素细胞黏附作用无显著性差异(t =1 4 5 ,P =0 .10 ) ,而促黑素细胞迁移作用有显著性差异(t =2 .2 1,P =0 .0 3)。结论 补骨脂、白芷均可通过增加黑素细胞黏附和/或迁移对白癜风产生治疗作用。<1> ParkYK ,KimNS ,HannSK ,etal.Identificationofautoantibodytomelanocy tesandcharacterizationofvitiligoantigeninvitiligopatients
.JDermatolSci,1996,11(2):111-120
<2> CuiJ,ShenLY ,WangGC .Roleofhairfolliclesintherepigmen tationofvitiligo.JInvestDermatol,1991,97(3):410-416
<3> HorikawaT ,NorrisDA ,YohnJJ ,etal.Melanocytemitogensin ducebothmelanocytechemokinesisandchemotaxis.JInvestdermatol,1995,104(2):256-259
<4> LeiTC ,VieiraWD ,HearingVJ.Invitromigrationofmelano blastsrequiresmatrixmetalloproteinase-2:impl icationstovitiligotherapybyphotochemotherapy.PigmentCellResearch,2002,15(6):426-432
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<6> 雷铁池,朱文元,夏明玉,等.89味中药乙醇提取物对酪氨酸酶活性的上调作用.临床皮肤科杂志,1999,28(3):147-149
<7> 李洪武,朱文元,夏明玉.赤芍等5种上调酪氨酸酶活性中药乙醇提取液对棕黄色豚鼠背部皮肤的增色作用.临床皮肤科杂志,2001,30(2):69-71
<8> KwokYK ,AnsteyAV ,HawkJL .Psoralenphotochemotherapy(P UVA )isonlymoderatelyeffectiveinwidespreadvitiligo:a10 yearret rospectivestudy.ClinExpDermatol,2002,27(2):104-110
<9> 傅琳玲,朱文元.单味中药对体外培养毛囊生长影响的研究.中国皮肤性病学杂志,2000,14(2):92-93440国家自然科学基金资助 (30 2 0 0 2 4 7)砘廴?西安交通大学第二医院!陕西西安
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