桑叶为桑科植物桑 Morus alba L.的干燥叶,具有疏散风热、清肺润燥、清肝明目的功效,用于风热感冒、肺热燥咳、头晕头痛、目赤昏花等症<1>。绿原酸是桑叶的有效成分之一,在 2000 版《中国药典》中无含量测定项。为了有效控制药材的质量,我们建立了桑叶中绿原酸的高效液相色谱测定方法。该方法简便、准确,不仅适用于桑叶药材的质量分析,还可供桑叶制剂借鉴。1仪器与试药 高效液相色谱仪:日本岛津LC-10ADVP泵;SPD-M10AVP 二极管阵列检测器;CLASS-VP/LC 色谱工作站。美国 7725 手动进样器。绿原酸对照品购自中国药品生物制品检定所(供含量测定用);桑叶购自河北省安国药市。乙腈为色谱纯,磷酸为优级纯,其他试剂均为分析纯。2 色谱条件 色谱柱:USA Agilent ZORBAX SB-C18 色谱柱(4.6 mm×150 mm,5 μm,);柱温:室温;流速:1.0 mL/min;
流动相:乙腈-0.1%
磷酸溶液(体积比为 9∶91);检测波长 327 nm;进样量 20 μL。理论板数按绿原酸峰计算不低于 2 000。HPLC色谱图见图 1。 注:1.桑叶供试品 2. 绿原酸对照品3 方法与结果3.1 对照品溶液的制备 精密称取干燥的绿原酸对照品约 10 mg,置 50 mL 棕色量瓶中,用甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,精密量取 5 mL,置 100mL 棕色量瓶中,加 50%甲醇至刻度,摇匀,即得(每 1 mL 含绿原酸 10 μg,10 ℃以下保存)。3.2 供试品溶液的制备 取本品粉末(过 3 号筛)约 0.2 g,精密称定,置锥形瓶中,精密加入 70%甲醇 20 mL,密塞,称定重量,超声处理 30 min,放冷,再称定重量,用 70%甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,续滤液用微孔滤膜(0.45 μm)滤过,取续滤液作为供试品溶液。3.3 线性关系的考察 配制绿原酸对照品溶液(0.20 mg/mL),稀释,使绿原酸的浓度分别为 0.001、0.005、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL 的溶液,进样各 20 μL,按拟定色谱条件测定。以对照品溶液(μg)为横坐标,以峰面积积分值为纵坐标,绘制标准 曲线,回归方程为:Y=72882419X+3952,r=0.9999。表明绿原酸进样量在0.02～2.0 μg 范围内与峰面积呈线性关系。3.4 精密度试验 精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20 μL,重复进样5次,测定峰面积,绿原酸对照品峰面积的 RSD=0.58%,供试品绿原酸峰面积的 RSD=0.52%。3.5 重复性试验 对同一批号的样品按取样量的 80%、100%和 120%称样(共9 份),依供试品溶液制备方法,在上述色谱条件下进样测定,计算,含量为 0.1683%、0.1677%、0.1681%、0.1655%、0.1661%、0.1659%、0.1610%、0.1617%、0.1603%,平均含量为 0.1650%,RSD=1.91%。3.6 回收率试验 精密称取半量已知含量的样品 9 份,分别按样品含量的80%、100%和120%加入绿原酸对照品(以溶液形式加入),按上述方法进行测定,计算回收率。结果见表 1。 表 1 桑叶中绿原酸的加样回收试验结果 样品中含绿 添加绿原酸 测出绿原酸 回收率 平均回收 RSD 原酸量(mg) 量(mg) 总量(mg) (%) 率(%) (%) 0.1663 0.1548 0.3210 99.94 0.1676 0.1548 0.3220 99.74 0.1671 0.1548 0.3208 99.29 0.1680 0.1935 0.3616 100.05 0.1675 0.1935 0.3609 99.93 99.05 1.01 0.1684 0.1935 0.3600 99.02 0.1614 0.2322 0.3884 97.76 0.1617 0.2322 0.3898 98.23 0.1624 0.2322 0.3887 97.463.7 稳定性试验 取同一对照品溶液和供试品溶液,分别在 0、3、6、20、24、28 h 进样测定,绿原酸对照品峰面积的 RSD=1.01%,供试品绿原酸峰面积的 RSD=1.04%。3.8 样品测定结果 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各 20 μL,注入液相色谱仪,测定,用外标法计算含量。结果见表 2。 表 2 桑叶药材中绿原酸的含量测定结果 样品编号 绿原酸含量(%) 1 0.21 2 0.19 3 0.16 4 0.114 讨论4.1 样品提取条件的比较 对比了桑叶用甲醇、50%甲醇与 70%甲醇提取的效果,所测含量甲醇提取者低于用含水甲醇提取者,50%甲醇与 70%甲醇的提取效果没有明显差异,由于 70%甲醇的提取易于滤过而被选用。对超声处理时间进行了考察,根据实验结果确定超声处理时间为 30 min。4.2 流动相与检测波长的选择 经对比,以乙腈-0.1%磷酸溶液(9∶91)为流动相时色谱分离效果好,pH 值较适宜,被确定。
绿原酸 HPLC 测定波长有327 nm<1-2>、330 nm<3>等报道。将绿原酸对照品溶液、供试品溶液分别注入液相色谱仪,以二极管阵列检测器进 行测定,得到它们的色谱扫描图及光谱吸收曲线。绿原酸对照品、供试品所含绿原酸的光谱吸收曲线相一致,均在326 nm 左右有最大吸收,确定 327 nm 为检测波长。绿原酸对照品、桑叶供试品色谱图以 327 nm 为检测波长,供试品与绿原酸对照品在相应位置上有相似的吸收峰且分离度良好。 由于绿原酸对光较敏感,长时间光照易分解,因此,对照品溶液应配制在棕色量瓶中,10 ℃以下保存。另外,对照品的稀释液不易长期保存,最好现用现配,实验也需避光进行。RP-HPLC测定桑叶中绿原酸的含量@徐韧柳$河北省药品检验所!河北石家庄050011
@李丽华$河北医科大学中医学院!河北石家庄050000
@康怀萍$河北科技大学!河北石家庄050000
高效液相色谱法;;桑叶;;绿原酸;;含量测定目的研究桑叶中绿原酸的高效液相色谱测定方法。方法以Agilent ZORBAX SB-C18为色谱柱,乙腈-0.1%磷酸溶液(9∶91)为流动相,检测波长为327 nm,流速1.0 mL/min,采用面积外标法计算。结果绿原酸进样量在0.02～2.0 μg 范围内与峰面积呈良好线性关系,r=0.9999,平均加样回收率为99.05%(RSD=1 .01%,n=9)。结论本方法简便、快速、准确,可用于桑叶的质量控制。<1>国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)
.北京:化学工业出版社,2000.244,177.
<2>祝德秋,崔岚,王晓珉,等.HPLC 测定清火颗粒中绿原酸的含量.中成药,2003,25(9):776.
<3>李文莉,汪文涛,曹湘萍,等.高效液相色谱法测定脉络宁注射剂中绿原酸的含量.中 国药学杂志,2003,38(3):210-212.-HPLC测定桑叶中绿原酸的含量@徐韧柳$河北省药品检验所!河北石家庄050011
@李丽华$河北医科大学中医学院!河北石家庄050000
@康怀萍$河北科技大学!河北石家庄050000高效液相色谱法;;桑叶;;绿原酸;;含量测定目的研究桑叶中绿原酸的高效液相色谱测定方法。方法以Agilent ZORBAX SB-C18为色谱柱,乙腈-0.1%磷酸溶液(9∶91)为流动相,检测波长为327 nm,流速1.0 mL/min,采用面积外标法计算。结果绿原酸进样量在0.02～2.0 μg 范围内与峰面积呈良好线性关系,r=0.9999,平均加样回收率为99.05%(RSD=1 .01%,n=9)。结论本方法简便、快速、准确,可用于桑叶的质量控制。<1>国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部).北京:化学工业出版社,2000.244,177.
<2>祝德秋,崔岚,王晓珉,等.HPLC 测定清火颗粒中绿原酸的含量.中成药,2003,25(9):776.
<3>李文莉,汪文涛,曹湘萍,等.高效液相色谱法测定脉络宁注射剂中绿原酸的含量.中国药学杂志,2003,38(3):210-212.
More abstracts about the RP-HPLC测定桑叶中绿原酸的含量