乙型病毒性肝炎(乙肝 )在我国感染面广,危害严重,目前尚缺乏切实有效的治疗措施。乙型肝炎病毒(HBV)是引起急 、慢性病毒性肝炎的主要病原体之一,故寻找有效的抗HBV药物是当务之急。海鞘(Ascidian)属于脊索动物门的尾索动物亚门,20世纪80年代以来,从中发现了许多抗肿瘤、抗病毒、抗微生物以及免疫调节、生物催化等生理活性物质 <1>。笔者探索皱瘤海鞘(Styelecplicata)有效部位的体外抗HBV作用,为进一步的研究海鞘的抗乙肝有效成分提供试验基础。1 材料与方法 1 1 材料 皱瘤海鞘采自广东大亚湾海域,样本经国家海洋局厦门第三海洋研究所郑成兴研究员鉴定 ,标本保存于第一军医大学药剂研究中心;表面抗原(HBsAg)、e抗原(HBeAg)ELISA检测试剂盒(上海荣盛生物工程公司,批号:20030430);D101型大孔吸附树脂(南开大学化工厂 );其他试剂均为分析纯。2 2 15细胞来自第一军医大学南方医院肝病研究所。DMEM培养基、培养液添加 10%胎牛血清、0 25%胰蛋白酶、380 μg·mL 1 G418, 均为GBICO公司产品, 100U·mL 1青霉素, 100U·mL 1链霉素, 400μg·mL 1四氮唑(MTT) (Sigma公司产品 ), 0 03%谷氨酰胺,用0 238% Hepes调pH值至 6 8。Σ960酶标仪 (台湾METERTECHINC公司生产)。1 2 实验方法 1 2 1 皱瘤海鞘有效部位的制备 新鲜皱瘤海鞘 50kg,去内脏,洗净,在室温下以 95%乙醇浸泡 1周,用旋转蒸发器低温回收乙醇,得提取物 35g。将提取物用 200mL纯化水尽量溶解,分别用相同体积的二氯甲烷、醋酸乙酯、正丁醇萃取,挥干溶剂,得到水溶部分23g。按文献<2>方法处理大孔吸附树脂后,将水溶部分上柱,先用 300mL纯化水洗脱,再用 95%乙醇洗脱,分别收集洗脱液,将水溶部分用树脂脱盐。水洗液加硝酸银出现白色沉淀,并可溶于氨溶液中,故可能为盐;将乙醇洗脱液浓缩至干,得海鞘有效部位约 11g。1 2 2 有效部位体外药效学试验 实验组用 0 25%胰蛋白酶将 2 2 15细胞分散成单个细胞悬液,按每孔3×104细胞分种于 96孔板, 2d后换用含药培养液,每个浓度加 4孔。含药培养液为皱瘤海鞘有效部位用DMSO液溶解后,用细胞维持液分别稀释成 64, 32, 16,8, 4, 2, 1mg·mL 17个浓度。与细胞作用 12d后,吸取上清液用ELISA法测定HBsAg、HBeAg的滴度 (以吸光度A值表示),余下细胞用MTT法测定药物细胞毒性。实验以未加任何药物的细胞培养液作为阴性对照组,以培养液作为空白对照组。1 2 3 MTT法测定药物对细胞生长的半数毒性浓度 实验组向细胞加入 400μg·mL 1 MTT溶液,每孔0 1mL, 37℃ , 5%二氧化碳孵育 4h,可见黄黑色甲瓒颗粒,弃去MTT溶液,加入 100% DMSO,每孔 0 1mL,待甲瓒颗粒完全溶解 (约 10min)后,用紫外分光光度计于波长 570nm处测定吸光度A值。空白对照加 4孔 100% DMSO,每孔 0 1 mL。细胞存活率(% ) =(实验组A值 /空白对照组A值 )× 100%,50%毒性浓度 (TC50 )为实验孔存活细胞为对照孔50%时的浓度, 50%抑制浓度 (IC50 )为HBsAg或HBeAg抑制率为 50%时的药物浓度。治疗指数 (TI)为评价药物临床应用前景的参数,TI=TC50 /IC50。相应计算出的治疗指数,其中TI> 2 为有效低毒,1≤TI≤2为低效有毒,TI<1为毒性作用 <3>。1 2 4 HBsAg、HBeAg的检测 采用华美公司ELISA试剂盒检测。抑制率(% ) =< (阴性对照组P(阳性 ) /N(阴性)值-实验组P/N值) /(对照组P/N值-空白对照组P/N值) >×100%。2 结果 2 1 皱瘤海鞘有效部位对HBsAg、HBeAg的抑制作用 结果见表 1。结果看出,皱瘤海鞘醇提物对2 2 15细胞分泌HBsAg、HBeAg两抗原具有明显抑制作用,其抑制率的大小与剂量有关。2 2 皱瘤海鞘有效部位的治疗指数 通过MTT法测定药物的细胞毒性浓度,结果见表 2,结果HBsAg的TC50 =28 5mg·mL 1,IC50 =2 2mg·mL 1,TI=12 9,HBeAg的TC50 =28 5mg·mL 1,IC50 =3 8mg·mL 1,TI=7 5。皱瘤海鞘有效部位对HBsAg、HBeAg的治疗指数均>2,可认为为有效低毒。表 1 皱瘤海鞘有效部位对 2 2 15细胞分泌HBsAg、HBeAg抗原抑制作用 x±s浓度/mg·mL 1HBeAgA值抑制率 /%HBsAgA值抑制率 /%实验组 64 0 43±0 04 80 13 0 19±0 07 86 2832 0 50±0 19 76 81 0 25±0 06 81 3516 0 54±0 13 74 92 0 33±0 14 74 788 0 66±0 11 69 23 0 47±0 12 63 274 1 04±0 02 51 20 0 53±0 07 58 342 1 22±0 22 42 67 0 65±0 11 48 491 1 21±0 12 43 15 0 63±0 09 50 12空白对照组 0 01±0 00 0. 02±0. 00阴性对照组 2 12±0 04 1 24±0 05 表 2 MTT法测定皱瘤海鞘有效部位对 2 2 15细胞的毒性作用 x±s组别剂量 /mg·mL 1 A值破坏率 /%实验组 64 0 53±0 05 73 8932 0 86±0 07 57 6316 1 74±0 08 14 288 1 98±0 18 3 944 1 99±0 23 1 972 2 01±0 11 0 991 2 07±0 22 -空白对照组 0 09±0 00阴性对照组 2 03±0 02 注:“-”细胞生长良好,破坏率为负值3 讨论 本研究对皱瘤海鞘抗乙肝有效部位进行了提取分离,并通过 2 2 15细胞模型测定了该有效部位抑制细胞分泌HBsAg、HBeAg的作用,结果证明皱瘤海鞘有 效部位体外具有明显的抗HBV作用,且细胞毒性较小,有望从海鞘中开发出有前景的抗乙肝药物。海鞘中的活性成分有生物碱、甾体化合物和肽类等<4>。从海鞘有效部位的来源分析,皱瘤海鞘抗乙肝活性成分可能为水溶性物质。笔者将采用体外 药效追踪和有效成分的分离相结合的方法,对皱瘤海鞘的有效成分进行进一步的分离纯化和结构鉴 定,以确定皱瘤海鞘抗乙肝作用的物质基础。皱瘤海鞘有效部位体外抗乙型肝炎病毒表面抗原和e抗原的研究@胡文军$第一军医大学分校药剂教研室!广州510315
@万新祥$第一军医大学分校药剂教研室!广州510315
皱瘤海鞘;;
2.2.15细胞株;;
乙肝表面抗原;;乙肝e抗原 目的 研究皱瘤海鞘有效部位的体外抗乙型肝炎病毒(HBV)的作用。方法 从新鲜皱瘤海鞘中提取分离皱瘤海鞘有效部位,应用HBV转染的22 15细胞株,测定培养上清液中表面抗原(HBsAg)、e抗原(HbeAg)滴度,作为药物抗 HBV效果的评价指标;并通过四氮唑(MTT)法测定皱瘤海鞘有效部位对细胞生长的半数毒性 浓度,测定药物治疗指数。结果 皱瘤海鞘有效部位对HBsAg、HBeAg的分泌均有较明显 的抑制作用,对细胞的毒性低,其治疗指数均>10。结论 皱瘤海鞘有效部位体外具有明显的抗 HBV作用。<1> 耿 越,张 薛,赵相轩海鞘类天然产物的最新研究进展
天然产物研究与开发,2002,13(6):73-78
<2> 凌宁生,刘志青,李 林,等中药用D 101型大孔树脂苯系列残留物分析研究中草药,2002,33(2):122-124.
<3> 马金霞,潘世扬,张 卫,等MTT比色法用于肿瘤细胞体外药物敏感性试验的检测临床检验杂志,2002,20(2):104
<4>BluntJW,CoppBR,MunroMH,etalMarinenaturalp roductsNatProdRep,2004,21(1):1-49广州市科技攻关项目(基金编号: 2002Z3 E0184)1 2 07±0 22 -空白对照组 0 09±0 00阴性对照组 2 03±0 02 注:“-”细胞生长良好,破坏率为负值3 讨论 本研究对皱瘤海鞘抗乙肝有效部位进行了提取分离,并通过 2 2 15细胞模型测定了该有效部位抑制细胞分泌HBsAg、HBeAg的作用,结果证明皱瘤海鞘有 效部位体外具有明显的抗HBV作用,且细胞毒性较小,有望从海鞘中开发出有前景的抗乙肝药物。海鞘中的活性
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