内皮细胞是血液与血管壁之间的结构和功能屏障,内皮细胞受损是动脉粥样硬化形成的始发因素,细 胞自身的脂质过氧化,氧自由基的产生是细胞受损的主要因素<1~5>,如何维持内皮细胞的正 常结构和功能,保护内皮细胞免受损伤,是防止动脉粥样硬化(AS)发生的关键,中药在这方面 越来越显示出较好的前景。何首乌是一种具有活血化瘀作用的中药,临床证实它对血栓性疾病有治 疗和预防作用<6,7>,本文利用体外培养内皮细胞为研究对象,以何首乌提取物作用内皮细胞 后检测其总抗氧化能力(T-AOC)、脂质过氧化物(LPO)、一氧化氮(NO)、超氧化物 歧化酶(SOD)代谢的变化,阐明何首乌对内皮细胞的抗氧化作用,为临床中药防治AS提供理 论依据。1材料与方法1.1实验材料及主要试剂:人脐静脉内皮细胞(细胞株ECV-304, 上海细胞所购买);何首乌提取物(苏州大学药物研究所协助提取,纯度70%);T-AOC, LPO,NO,SOD试剂盒(南京建成生物制品有限公司购买)。1.2何首乌提取物的配置: 称取何首乌提取物5mg用50μl二甲基亚砜溶解,然后从中吸取10μl何首乌溶液放入20 ml无血清1640培养基中,使何首乌提取物的终浓度为50mg/L;另外吸取10μl二甲 基亚砜放入20ml无血清1640培养基中(作对照用),使二甲基亚砜终浓度为0.05%, 两种液体经抽滤除菌后备用。1.3内皮细胞的培养及实验步骤:将传代人脐静脉EC用含10% 小牛血清RPMI1640培养基按1×105/ml培养于24孔培养板中,在37℃、5%C O2条件下培养24h后,实验分3个何首乌作用组(DS-Ⅰ,DS-Ⅱ,DS-Ⅲ),3个二 甲基亚砜对照组(SMO-Ⅰ,SMO-Ⅱ,SMO-Ⅲ)和1个空白对照组(Control) ,每小组6孔,何首乌作用组用配置好的无血清1640何首乌液,其浓度分别为50mg/L、 25mg/L、12.5mg/L,二甲基亚砜对照组其浓度分别为0.05%,0.025%, 0.0125%,空白对照组用无血清RPMI1640培养基,作用18h后全部弃培养液,用 胰酶消化,离心收集细胞,每孔收集的细胞装入1.5ml离心管加入1ml三蒸水,用JY92 -Ⅱ型超声波细胞粉碎仪打碎细胞,4000转/分钟离心后收上清液-20℃保存。1.4T- AOC、LPO、NO、SOD测定:所有测定步骤按试剂盒操作说明进行,用SP-2102U V紫外分光光度3讨论内皮细胞受损是AS发生发展的始发因素,研究对内皮细胞的保护是从根本 上防治心血管疾病发生的关键。祖国医学认为中药何首乌具有活血化瘀的作用,且副作用极小,许 多实验和临床研究证实何首乌中的有效成分有保护心肌细胞和内皮细胞的作用<2,8,9>,但 这些研究主要从治疗角度,也就是说当内皮细胞或心肌细胞受到外来损伤时,何首乌具有保护作用 。而内皮细胞在正常没有受到外来损害情况下,何首乌是否对心肌细胞同样具有保护作用未见报道 。本文通过何首乌提取物作用于体外培养的内皮细胞,检测其抗氧化指标T-AOC、LPO、N O、SOD的变化,以探讨何首乌对正常内皮细胞是否有提高其抗氧化能力,从而为寻找或筛选有 效心血管保健预防药物提供依据。本文结果表明,何首乌提取物计测其光密度(IOD)值。1. 5统计学分析:所有数据均以x±s表示,组间作t检验。2结果从表1可以看出对照组所用的二 甲基亚砜对T-AOC有上调作用,对LPO、NO和SOD有下调作用,但各对照组间不同浓度 的二甲基亚砜对T-AOC、LPO、NO和SOD的作用无显著性差异,分别P>0.05。从 实验组来看,何首乌提取物对T-AOC、LPO、NO和SOD的代谢都有影响,其中对T-A OC和NO有上调作用,并有浓度依赖关系,对SOD只有25mg/L和12.5mg/L组有 上调作用,与对照组间有显著性差异(P<0.05),50mg/L组则无上调作用;而对LP O25mg/L和12.5mg/L组有下调作用,与对照组间有显著性差异(P<0.05), 50mg/L组无下调作用。表1不同浓度何首乌提取物作用于内皮细胞后对T-AOC、LPO 、NO、SOD测定结果(x±s,n=6)组别T-AOCLPONOSODDS-I1.02 0±0.1270.303±0.1070.0615±0.00926.900±0.804D S-II0.465±0.0650.227±0.0750.0410±0.00609.00 5±0.417DS-III0.399±0.1330.227±0.0640.0311±0 .00548.987±0.709SMO-I0.340±0.0660.303±0.097 0.0310±0.00568.540±0.492SMO-II0.355±0.0630. 303±0.0010.0272±0.01008.635±0.776SMO-III0.3 33±0.1150.303±0.0850.0270±0.00568.670±0.453 Control0.166±0.0570.378±0.0270.0467±0.00849 .890±0.519对体外培养的内皮细胞具有提高其抗氧化能力,主要过程是通过降低其脂质 过氧化作用,提高清除氧自由基的能力和提高具有保护作用的NO来提高细胞的抗氧化能力,达到 对内皮细胞的保护作用。对于何首乌提取物的作用浓度本文的实验结果是:在细胞密度为1×10 5个/ml时12.5~25mg/L为最佳,本文这个结果仅仅是在体外细胞培养条件下,对于 体内血管壁的内皮细胞是否也有这种保护作用,以及最佳作用剂量都应建立动物模型,在整体水平上作进一步研究。何首乌提取物对内皮细胞T-AOC、LPO、NO、SOD代谢的影响@王旻晨!215007$苏州大学医学院
@吴开云!215007$苏州大学医学院
@杨亚安!215007$苏州大学医学院内皮细胞;;何首乌;;脂质过氧化物;;总抗氧化能力 ;;一氧化氮;;超氧化物歧化酶目的探讨何首乌提取物对正常内皮细胞的保护作用。方法体外培 养内皮细胞,用不同浓度的何首乌提取物分别作用于内皮细胞,检测其总抗氧化能力(T-AOC )、脂质过氧化物(LPO)、一氧化氮(NO)、超氧化物歧化酶(SOD)的变化。结果何首 乌提取物对内皮细胞T-AOC和NO有上调作用,并有浓度依赖关系,对SOD25mg/L和 12.5mg/L组有上调作用,50mg/L组则无上调作用,而对LPO25mg/L和12 .5mg/L组有下调作用,50mg/L组无下调作用。结论何首乌提取物对体外培养的内皮细 胞具有保护作用,为临床选择有效保护内皮细胞的药物提供了依据。1宋士军,李芳芳,丘华,等.何首乌的抗疲劳及耐缺氧作用研究.河北中医药学报,2003,18,(3):32-33
2李林,刘治军.何首乌成分二苯乙烯苷对急性脑缺血动物模型的影响.中国药理通讯,2003,19,(4):46
3李丽春,吴晓东,田维熙,等.何首乌提取物对脂肪酸合酶的抑制作用.中国生物化学与分子生物学报,2003,19,(3):297-304
4张黎,芮耀诚,邹彦,等.何首乌水溶性成分2,3,5,4,-四羟基二苯乙烯2-O-β-D 葡萄糖苷I(STI)对内皮细胞表达VEGF的影响.中国药理通讯,2003,20,(2):56
5杨鹏远,芮耀诚.何首乌总二苯乙烯苷对实验性动脉粥样硬化的保护作用及机制.中国药理通讯,2002,19,(4):63
6李建平.何首乌药理作用研究近况.中国药业,2003,12,(1),74-75
7杨朝哗.何首乌抗衰老作用研究近况.时珍国医国药,1999,10,(5):390-391
8苗明三,方晓艳.制何首乌多糖对衰老模型小鼠抗氧化作用的研究.中药药理与临床,2002,18,(5):23-24
9吕金胜,向明凤.何首乌抗动物急性炎症的初步研究.中国药房,2001,12,(12):7 12-714馄渥芸寡趸芰?T-AOC)、脂质过氧化物(LPO)、一氧化氮(NO)、超 氧化物歧化酶(SOD)的变化。结果何首乌提取物对内皮细胞T-AOC和NO有上调作用,并 有浓度依赖关系,对SOD25mg/L和12.5mg/L组有上调作用,50mg/L组则无 上调作用,而对LPO25mg/L和12.5mg/L组有下调作用,50mg/L组无下调作 用。结论何首乌提取物对体外培养的内皮细胞具有保护作用,为临床选择有效保护内皮细胞的药物 提供了依据。1宋士军,李芳芳,丘华,等.何首乌的抗疲劳及耐缺氧作用研究.河北中医药学报,2003,18,(3):32-33
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9吕金胜,向明凤.何首乌抗动物急性炎症的初步研究.中国药房,200
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