近年有研究发现青蒿素对矽肺有明显的治疗作用<1 > 。我们利用兔耳制作增生性瘢痕模型 ,用青蒿琥酯钠做局部瘢痕内注射 ,观察其对瘢痕形成的影响 ,对青蒿素治疗增生性瘢痕的作用机制做进一步研究 ,为临床应用提供理论依据。1 材料与方法1 1 动物模型的制作选用健康成年新西兰大白兔 6只 (购自重庆医科大学动物实验中心 ) ,兔耳健全 ,雌雄不拘 ,体重 2～ 2 5kg ,分笼饲养。动物瘢痕模型的制作参照Morris<2 > 方法并加以改良 :用3%戊巴比妥钠 1 5mg kg做耳缘静脉麻醉 ,严格无菌操作技术下 ,在兔耳腹侧做 1cm× 1cm大小创面 ,去掉兔耳全层皮肤及软骨膜 ,创缘用烙铁烧灼 ,每只兔耳做 6个相同创面 ,共 72个创面 ,术后创面暴露 ,待创面自行愈合 ,一般需 16～ 19d左右。兔耳创面上皮化后 (术后 19d) ,选择兔左耳瘢痕做为青蒿琥酯钠组 ,兔右耳增生性瘢痕做为对照组。青蒿琥酯钠组用青蒿琥酯钠 (广西桂林第二制药厂惠赠 )加 5 %NaHCO3配成 6 0mg ml,用微量注射器做局部瘢痕内注射 ,从瘢痕周围的正常皮肤进针 ,每处瘢痕注药量为 2 0 μl。对照组用 5 %NaHCO3做局部瘢痕内注射 ,每处 2 0 μl。每隔 2d 1次 ,共5次。1 2 标本收集用药后 15d ,用 3%戊巴比妥钠 1 5mg kg做耳缘静脉麻醉 ,切取标本。做HE、VG染色的标本用 4 %中性甲醛固定。氯胺T测胶原标本用深低温冰箱 - 80℃保存。1 3 羟脯氨酸测定1 3 1 标准曲线的绘制 用羟脯氨酸标准品 (中国科学院上海生物化学研究所 )按文献 <3>制作标准曲线。1 3 2 样品测定 称取瘢痕组织块 2 0mg ,剪成 1mm× 1mm× 1mm大小后装于安瓿中 ,加入 6mol LHCl 1ml,酒精喷灯封口 ,130℃烤箱内烤 3h。冷却后加入 10mol LNaOH 0 5 5ml,调节pH值至 5～ 7。样品定容于 5ml,吸样品 0 1ml稀释成 1ml,取 0 2ml稀释液加入试管内 ,标准管加 0 2ml浓度为 10 μg ml羟脯氨酸标准液 ,空白管加 0 2ml蒸馏水代替。按文献 <4 >测量样品羟脯氨酸含量 ,根据公式羟脯氨酸含量(μg mg) =样品吸光度 标准管吸光度× 10× 5 0 2 0计算羟脯氨酸在 1mg组织 (湿重 )中的含量。1 4 统计学处理SAS 6 12软件包进行数据处理 ,用 x±s表示 ,进行配对t检验和直线回归分析。2 结果2 1 大体观察显微镜下用测微尺测量相对增生厚度 ,青蒿琥酯钠组兔耳瘢痕质地较柔软平整 ,瘢痕增生高度为 (3 5 6± 1 0 4 )mm。对照组瘢痕增生明显 ,突起高于皮面 ,高度为 (4 4 5± 0 81)mm。两组比较差异具有统计学意义 (P <0 0 1)。2 2 HE和VG染色对照组真皮层较厚 ,成纤维细胞多 ,胶原纤维致密粗大 ,胶原纤维排列紊乱 ,可见漩涡状结构和胶原结节 (图 1)。青蒿琥酯钠组成纤维细胞数量较少 ,胶原较疏松 ,排列较整齐(图 2 )。2 3 羟脯氨酸测定结果2 3 1 羟脯氨酸标准曲线 用SAS统计软件包做回归性分析得直线回归方程 ^Y =0 2 86x - 0 0 311,R2 =0 99(图 3)。根据标准曲线方程可知吸光度同溶液中羟脯氨酸浓度呈正相关 ,用测得吸光度可计算出羟脯氨酸含量。2 3 2 样品羟脯氨酸测定结果 青蒿琥酯钠组为 (16 2 7±1 77) μg mg,对照组为 (2 4 85± 1 5 5 ) μg mg,两组比较差异具有统计学意义 (P <0 0 1)。3 讨论3 1 动物瘢痕模型创伤后瘢痕愈合是人类特有的一种病理现象 ,瘢痕增生不仅影响外观 ,而且常导致功能障碍<5> 。由于动物难以形成瘢痕的特性使瘢痕研究受到限制 ,因此 ,建立一种有效的动物模型一直是国内外医学工作者努力的方向。1997年Morris等<2 > 发现兔耳创面有真皮过度增生现象 ,1998年国内学者报道建立兔耳增生性瘢痕模型的研究资料<6 > ,并对组织学和增生块中Ⅰ、Ⅲ型胶原的构成以及TGF β1 mRNA的表达加以研究 ,证实兔耳增生性瘢痕与人类增生性瘢痕发生过程及其结构都很相似<4 ,7> 。在实验中我们发现创面做得越大创面组织增生越明显 ,考虑到创面比较小瘢痕增生较小不利于研究 ,故我们在实验中于兔耳腹侧做 1cm×1cm创面 ,同时为了防止创面收缩 ,在去除皮肤和软骨膜后创缘用电烙铁烧灼。在实验中观察到兔耳瘢痕增生发生在创面上皮化后 (术后 19d) ,到上皮化后 30d增生达最高 ,可维持 2～ 3个月 ,以后逐渐软化、变薄 ,同人类增生性瘢痕变化类似<2 ,8,9> 。我们认为在目前缺乏其他更好的动物瘢痕模型时 ,本模型不失为一种较好的选择图 1 对照组兔耳增生性瘢痕胶原排列紊乱 ,VG× 2 0 0 图 2青蒿琥酯钠组兔耳增生性瘢痕胶原排列较整齐 ,VG× 2 0 0Fig 1 Controlgroupshowscollagendisorder,VG× 2 0 0Fig 2 Artesunategroupshowscollagenwell arranged ,VG× 2 0 0 图 3 羟脯氨酸标准曲线Fig 3 Standardcurveofhydroxyproline 3 2 青蒿琥酯钠对瘢痕中胶原的影响胶原是瘢痕组织中细胞外基质的主要成分 ,羟脯氨酸(4 羟脯氨酸 )做为蛋白质的组成部分而存在于胶原中。在胶原中羟脯氨酸含量比例相当稳定 ,约占 12 5 % ,测定羟脯氨酸含量可间接了解组织中胶原蛋白的含量。我们用氯胺T法测定兔耳增生性瘢痕组织中羟脯氨酸的含量 ,可以间接反映其胶原蛋白的含量。青蒿素是我国药学工作者自主开发的一个具有过氧桥的倍半萜内酯类化合物 ,在以后的研究中发现青蒿素及其衍生物具有广泛的药理作用。有文献<1 0 > 报道临床应用青蒿素治疗矽肺疗效可靠、安全。动物实验<1 > 也表明青蒿素对实验性矽肺有明显的预防和治疗作用 ,阻抑肺重和肺胶原。贺光照等<1 1 > 通过临床观测发现用青蒿素霜剂局部治疗增生性瘢痕后 ,瘢痕质地变软、变平。但其治疗机理不详 ,本实验测定瘢痕中羟脯氨酸含量显示青蒿琥酯钠组低于对照组 ,两组比较差异具有统计学意义 (P <0 0 1)。证明青蒿琥酯钠能减少瘢痕中胶原的含量。青蒿琥酯钠组兔耳瘢痕质地软柔软平整 ,青蒿琥酯钠相对增高指数较对照组低 ,两组比较差异具有统计学意义 (P<0 0 1)。HE和VG染色提示对照组真皮层较厚 ,胶原致密粗大 ,胶原排列紊乱 ,可见漩涡状结构和胶原结节。青蒿琥酯钠组较对照组薄 ,成纤维细胞数量较少 ,胶原较疏松 ,排列较整齐 ,提示青蒿琥酯钠对瘢痕形成有抑制作用。曹治东等<1 2 > 发现青蒿素能抑制体外成纤维细胞增殖和胶原合成 ,我们在实验中也发现青蒿琥酯钠对在体成纤维细胞的增殖有抑制作用 (另文发表 )。青蒿琥酯钠通过抑制成纤维细胞的增殖 ,影响胶原的合成 ,抑制瘢痕增生。深入研究青蒿素对瘢痕的作用机理 ,可以为中医药治疗瘢痕开辟一条新途径。青蒿琥酯钠对兔耳增生性瘢痕胶原的影响@李伟!400014$重庆市急救医疗中心整形与颅颌面外科
@石崇荣$重庆医科大学附属第一医院烧伤整形科
@曹治东!400014$重庆市急救医疗中心整形与颅颌面外科
@黄崇本$重庆医科大学附属第一医院烧伤整形科
@吴一!400014$重庆市急救医疗中心整形与颅颌面外科1 徐德忻,张维德,代长生,等.青蒿素对实验性矽肺的预防、病后治疗观察.医学研究通讯,1998,27:4344.
2 MorrisDE ,WuL ,ZhaoLL ,etal.Acuteandchronicanimalmodelsforexcessiv edermalscarring:quantitative.PlastReconstrSurg,1997,100:674681.
3 <苏>B .H .奥列霍维奇编著.现代生物化学方法.北京:人民卫生出版社,1980.70.
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