1 端粒的结构和功能端粒是真核生物染色体 3′末端、由富含G的DNA重复序列和端粒结合蛋白 (telomerebindingproteins,TBPS)组成的核蛋白复合物 ,其功能主要是维护染色体稳定 ,防止染色体发生丢失、重排、末端融合和被酶消化降解等<1> 。人的端粒于 1988年被克隆 ,其重复序列为 5′ - (TTAGGG)n- 3′,长度在 5～ 15KB范围内。最近的研究表明 ,端粒的结构比预想的要复杂得多 :首先 ,端粒不是线性末端 ,而是 3′端富含G的序列 (称为T环 )插入端粒重复序列的双链之间置换形成环状结构 ,称之为D环 ,端粒重复序列结合因子 2 (telomericrepeatfactor 2 ,TRF2 )就结合于此处 ,T-环的基本作用是提供端粒保护和复制端粒。端粒相关蛋白可能参与维持T环和D环的稳定 ,因而在每条染色体末端有大量的DNA—蛋白质复合物。其次 ,大多数端粒的 3′端有一个富含GT的突出末尾。有研究认为它在端粒的结构和功能方面有重要作用。这些有关端 粒结构的新发现给药物设计开发提供了更多的靶点。端粒的长度在不同的细胞之间存在差异。胚胎细胞和生殖细胞端粒的长度大于体细胞<2> 。人类正常体细胞的端粒随细胞分裂而缩短 ,即细胞每分裂 1次 ,端粒会缩短 5 0 2 0 0bp ,至一个临界点时 ,细胞发生衰老。如果此时端粒酶被激活 ,端粒得以延长 ,并维持一定的长度 ,则细胞越过临界状态而获得永生 ,从而有可能导致肿瘤的发生。2 端粒酶的结构和功能端粒酶是由端粒RNA和蛋白质组成的核糖核蛋白酶 ,通过识别并结合于富含G的端粒末端 ,以自身为模板逆转录合成端粒。 1995年Feng<3 > 等首次克隆了人类端粒酶RNA基因。在长约 4 5 0个碱基的人端粒酶RNA (HTR)序列中 ,有一段长 11个核苷酸的区域 (5′ CUAACCCUAAC - 3′)与人端粒序列 (TTAGGG)n互补。如其中的DNA模板发生改变 ,就会对细胞的生长造成严重的影响。近来的研究发现 ,HTR在 97%的肿瘤中都有较高的表达<3 > 。但是HTR水平并不能代表端粒酶活性水平 ,缺乏端粒酶活性的细胞同样可以有HTR的表达。人B细胞永生化前后端粒酶RNA的量没有明显变化 ,端粒酶活性却上升了 5 0 0～ 180 0倍<4> 。可见端粒酶RNA的表达是一个普遍现象 ,只是在正常组织细胞中表达量较低而已 ,端粒酶RNA表达量上调是激活端粒酶过程中的早期事件 ,端粒酶RNA量与端粒酶活性间没有平行关系。相对于端粒酶RNA ,端粒酶蛋白的研究要滞后一些。目前主要认为组成端粒酶的蛋白至少有 3个亚基 :hTERT、HEST2和TP1。与端粒酶RNA成分不同 ,端粒酶蛋白催化亚单位 (hTERT)总是与酶活性同时出现 ,或者都不存在。将hTERT基因导入端粒酶阴性的正常体细胞 ,可以实现端粒酶活性重建<5> ,使细胞端粒延长并得以永生化。说明hTERT是端粒酶的催化亚基和活性中心 ,是决定端粒酶活性的关键因素。另外 ,HEST2基因在肿瘤细胞、细胞系及新生化过程中也有与端粒酶类似的高表达<6> 。TP1或TP2基因的突变均可导致端粒酶的失活<7> 。3 端粒酶活化作为肿瘤诊断的标志物癌细胞的永生化是肿瘤细胞区别于正常细胞的重要特征之一 ,也是肿瘤生长和转移的关键。自从 1989年Morin首次在人癌细胞中发现端粒酶以来 ,肿瘤细胞永生化的“端粒—端粒酶”假说已为越来越多的研究结果所证实。迄今发现 85 %～ 90 %的人肿瘤细胞中可以检测到端粒酶活性 ,而与肿瘤相邻的正常组织或良性病变仅为 4 %左右或几乎没有端粒酶活性。因此端粒酶已成当今新的肿瘤标志物 ,是肿瘤基因治疗中的一个新的理想靶点。人们推测肿瘤细胞逃避衰老持续增殖是端粒酶激活或端粒维持机制改变的结果。端粒酶激活有两种模式 :反应模式和扩展模式。前者依赖端粒的长度 ,肿瘤细胞主要来自端粒酶阴性的前体细胞 ,当端粒缩短到一定程度后才会激活端粒酶 ;后者不依赖端粒的长度 ,肿瘤细胞主要来自具有端粒酶活性的细胞群 ,在肿瘤发生中出现较早。一般认为 ,端粒酶的激活是恶性肿瘤发生过程中的一个后期事件 ,使肿瘤细胞的端粒不再进行性缩短而得以维持 ,避免了细胞正常的复制—衰亡机制的制约而获得永生化。研究表明 ,端粒酶在各种肿瘤中的阳性率分别为<8> :中腔鳞状细胞癌 80 %～ 90 % ,食道癌 87% ,胃癌 85 % ,肺癌 80 1% ,肝癌 85 % ,乳腺癌85 % ,肾癌 71% ,胰腺癌 95 %等。说明端粒酶阳性率与肿瘤发生之间表现出良好的相关性。一般来说 ,端粒酶活性越高 ,肿瘤的恶性程度也越高 ,端粒酶活性较低者一般预后相对较好 ,而端粒酶活性较高者常表现为复发、耐药及预后不良。但是 ,端粒酶活化并不是肿瘤恶性所必要的 ,因为约有 15 %的肿瘤为端粒酶阴性 ,如胶质瘤中端粒酶阴性但肿瘤却是恶性的。4 抗癌药物的新靶点4 1 以端粒酶RNA为靶点4 1 1 反义寡核苷酸 (antisenseoligodexoynuclectide ,A SODN) 近几年来 ,国内外不少学者开展针对端粒酶的反义核酸技术<9,10 > 尤其是核酸<11,15> 方面的研究工作 ,结果发现针对端粒酶的反义核酸技术可使恶性肿瘤细胞端粒酶活性降低、增殖能力下降或出现凋亡。端粒酶RNA序列中有与端粒DNA序列互补的模板序列 ,针对该模板序列设计的反义核苷酸可抑制端粒酶合成端粒序列。Feng等<2 > 首先用含反义人端粒酶HTR的质粒转染Hela细胞 ,经过 2 3～ 2 6倍增时间 ,随着端粒酶活性的抑制及端粒长度的缩短 ,Hela细胞生长进入危机并大量死亡。Norton等<16> 针对端粒酶RNA模板设计了不同长度的反义肽苷酸 (PNA) ,实验显示PNA对细胞抽提物中的端粒酶和细胞内端粒酶在低浓度下 (IC5 0 0 9nmol/L)即有显著抑制作用 ,抑制效果严格取决于端粒酶RNA组分的模板区。Mattes认为<17> PS—ODN(硫代反义寡核苷酸 )的反义效果优于PNA。PS—ODN不仅能有效抑制细胞抽提物中的端粒酶活性 ,诱导细胞凋亡 ,更重要的是 ,利用异种移植人类肿瘤的裸鼠模型进行体内试验 ,证实PS—ODN可导致原位肿瘤体积缩小以及转移瘤结节数目减少。因而PS—ODN是一种有效端粒酶抑制剂 ,极有前景的化疗新药。但是反义寡核苷酸仍存在一些尚需解决的难题 :(1)稳定性 ,即ODN易被核酸酶降解。 (2 )穿透性 ,即细胞摄取AS—ODN的效率有待提高。 (3)有效性 ,ODN的非特异性结合降低了其效力。 (4)毒性作用。对此Herbert等<18> 对用反义寡核苷酸抑制乳腺上皮HME5 0- 5E细胞端粒酶活性的用药方式及用药剂量进行了深入的研究。但是也有些质疑者 ,如Gan等<19> 应用反义核酸抑制卵巢癌SKOV— 3细胞端粒酶活性 ,端粒的长度并未缩短 ,细胞也没有凋亡。这就使得人们怀疑ASODN的作用机制是否是基于抑制端粒酶活性和诱导端粒缩短。尽管如此 ,由于AS—ODN合成方便 ,安全性高且能直接作用到基因表达的不同水平 ,所以AS—ODN的研究和应用前景仍较为乐观。4 1 2 核酶 核酶是一种存在于细胞核具有核酸内切酶活性的小分子RNA ,不仅与靶序列反义结合 ,而且特异性将其水解 ,又称“基因剪刀”。Yokoyama等<12 > 设计了针对HTR的 3个锤头型核酶 (Telo -RZ) ,将其RNA导入Ishikawa子宫骨膜癌细胞 ,细胞的端粒酶活性降低。Kanaza wa等<2 0 > 在体外试验中发现Telo -RZ能成功地将含HTR模板区序列的 15 7个碱基的核酶底物切割成 10 4和 5 3个碱基的产物片段。Telo -RZ与肝癌细胞株HepG2和Huh - 7的细胞抽提物共育 ,端粒酶活性明显受抑制。屈艺等<13 ,14 > 设计了针对HTR模板区的核酶 ,发现转染其真核表达质粒的Hela细胞大量凋亡。体内试验发现 ,此真核表达质粒能明显抑制裸鼠移植瘤生长。赵颖海等<15> 研究发现端粒酶核酶基因teloRZ7 1的导入可使鼻咽癌CNE— 2Z细胞的增殖能力下降并可诱导CNE— 2Z细胞凋亡。QU等<11> 设计针对hTERTmRNA的核酶 ,能使转染细胞端粒酶活性降低 ,通过对几个核酶的比较认为针对 5′末端的核酶作用较强。核酶仍有望成为广谱、低毒、高效的抗癌新药。4 2 以端粒酶催化蛋白亚基单位 (hTERT)为靶点 hTERT是一个单拷贝基因 ,定位于 5P15、 33约 4 0KB。自从hTERT基因克隆出来后日益引起重视。已证实hTERT基因与肿瘤关系最为密切 ,是肿瘤反义药物治疗的新靶点。李文瑜等<2 1> 证实hTERT基因反义核酸降低Jurkat细胞端粒酶活性的表达 ,且呈时间依赖性。hTERT的基因表达的调控 ,则主要表现在mRNA转录水平。利用hTERT启动子的癌细胞相对特异的转录活性 ,可将其作为肿瘤基因治疗靶标。但是hTERTmRNA在良恶性肿瘤分化的临床应用上并不是一个可靠的靶点<2 2 > 。此外 ,根据hTERT基因表达调控机制 ,将癌细胞端粒酶控制在“关闭”状态 ,则有望开辟肿瘤基因治疗的新途径。4 3 以端粒酶作用的底物—端粒为靶点 hTR以其自身为模板反转录合成端粒DNA过程中 ,依赖 4种三磷酸单核苷酸的参与 ,故可利用核苷类似物竞争性抑制反转录过程 ,以抑制端粒酶活性 ,阻止端粒延长 ,从而使肿
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