心理应激是导致焦虑性及抑郁性神经症等多种精神疾病发生的重要病因。调查资料显示 :焦虑或抑郁症的发生通常是反复心理应激的结果<1> 。帕罗西汀 (paroxetine ,商品名赛乐特 ,Seroxat)是治疗广泛焦虑症的选择性 5 HT再摄取抑制剂 (SSRI) <2 > ,虽然临床上帕罗西汀广泛用于各种应激相关障碍的治疗 ,但是它的作用机制的研究还只停留在神经递质与受体的水平 ,基因水平的药理机制尚不是十分清楚。本文采用免疫组织化学方法观察帕罗西汀对心理应激诱导的c fos蛋白在大鼠下丘脑视旁核表达的影响 ,旨在探讨帕罗西汀减轻心理应激所致焦虑症状的中枢药理作用机制 ,为其合理应用提供理论依据。1 材料与方法1.1 药品、试剂与仪器 c fos检测免疫组化试剂盒 :购于北京中山生物技术有限公司 ;皮质醇放射免疫试剂盒 :购于北京中山生物技术有限公司。盐酸帕罗西汀 :白色粉末状可溶于水 ,批号 :990 1136 ,由上海葛兰素史克公司提供 ,溶于蒸馏水配制成所需浓度 ,ip体积为 1ml·kg-1。大鼠行为测定仪 :自制。1.2 动物分组 SD清洁级大鼠 ,雌性 ,7～ 8周龄 ,180～ 2 0 0g ,由温州医学院实验动物中心提供 (动物合格证号 :浙医字第 2 2 0 0 30 0 2 ) ,将大鼠置于室温 2 1～ 2 3℃、相对湿度 4 5 %、12h昼夜周期的动物室内。笼养 ,每笼 4只 ,自由进食、饮水。 32只大鼠随机分为 4组 ,每组 8只 :正常对照组 ,束缚应激组 ,单次给药束缚应激组 ,连续 6d给药束缚应激组。1.3 动物模型制作 实验前 ,动物在实验室条件下适应至少 1周。每天上午 8 0 0将造模大鼠置于特制的限制器内 ,每日 1次 ,每次 2h ,造模大鼠在限制期间禁食 ,禁水 ,连续 6d<2 > 后处死。正常对照组在同一时间也禁食 ,禁水。每天上午 8 0 0～ 9 0 0 ,正常对照组和束缚应激组大鼠腹腔注射等量的蒸馏水 ,连续 6d ,单次给药束缚应激组大鼠连续腹腔注射等量的蒸馏水 5d后 ,d 6腹腔注射盐酸帕罗西汀1ml·kg-1,连续 6d给药束缚组大鼠腹腔注射盐酸帕罗西汀 1ml·kg-1,连续 6d。1.4 放射免疫法检测血浆皮质醇 腹主动脉取血 ,抗凝离心制备血浆 ,- 2 0℃冻存 ,操作按照放射免疫试剂盒说明书要求进行。1.5 麻醉、灌注、固定、切片 在 10 %水合氯醛(3ml·kg-1)麻醉下 ,经左心室至升主动脉插管 ,先快灌流 0 .9%氯化钠溶液 10 0～ 15 0ml,再慢灌注含4℃的 4 %多聚甲醛 (0 .1mol·L-1)磷酸缓冲液10 0ml。立即取脑固定于 4 %多聚甲醛中 2 4h ,再移至 2 0 %蔗糖磷酸缓冲液中过夜 (4℃ )至脑组织块沉底 ,次日连续冠状冰冻切片 ,切片厚 30 μm。取含下丘脑最大断面的切片 (参照图谱theFourthEditionoftheRatBraininStereotaxicCoordinates) ,收集于0 .0 1mol·L-1的PBS缓冲液中。1.6 c fos免疫组织化学染色 采用SP二步法 :用多聚赖氨酸处理过的玻片捞片 ,置 6 0℃烤箱烤30min ,以使切片紧密粘附 ,依次以下步骤操作 :3%过氧化氢孵育 5min ,以阻断内源性过氧化酶 ;滴加兔来源的c fos 1 10 0 ,30～ 5 0 μl,室温孵育 90min ;滴加山羊抗兔IgG抗体 HRP多聚体 ,5 0 μl,室温孵育 2 0min ;应用DAB溶液显色 (双蒸水 1ml ,A :5 0 μl,B :5 0 μl,避光保存 ,30min用完 ) ,在显微镜下观察 ;蒸馏水冲洗 ;苏木素复染 ;蒸馏水冲洗 ;脱水 :70 %酒精 1次 ,75 %酒精 1次 ,95 %酒精 2次 ,无水酒精 2次 ,2 甲苯 2次 ,各 3min ;中性树胶封片。上述每步骤间均采用PBS充分洗涤。对照实验 :取部分切片用 0 .0 1mol·L-1PBS液代替兔来源的一抗进行孵育 ,其余步骤相同。1.7 图像分析 用HPLAS 10 0 0高分辨彩色病理图文分析系统行Fos样免疫阳性神经元记数。所有切片均在同一光强度和同一放大倍数 (× 4 0 0 )下分析。观察每只鼠含有室旁核神经元的所有切片 ,以最高密度切片为代表 ,测定每个视野内fos样免疫阳性细胞数。1.8 统计学处理 应用SPSS 11.0统计软件完成 ,用c fos阳性细胞数占该切片观察细胞总数的百分率表示c fos阳性细胞密度 ,数据以均数±标准差 (x±s)表示 ,进行方差分析 ,P <0 .0 5为差异有显著性。2 结果2 .1 帕罗西汀对应激大鼠血浆皮质醇的影响 各应激组大鼠血浆皮质醇含量明显高于正常对照组(P <0 .0 5 ) ,帕罗西汀单次、连续 6d给药可减少束缚应激大鼠血浆皮质醇含量 ,和束缚应激组比较有明显下降 (P <0 .0 5 )。帕罗西汀连续 6d给药比单次给药对束缚应激大鼠血浆皮质醇下降作用更明显(P <0 .0 5 ,表 1)。2 .2 帕罗西汀对应激大鼠下丘脑fos样免疫阳性神经元数量的影响 光镜下观察 ,DAB显色的免疫反应终产物fos呈棕黄色颗粒状 ,位于神经细胞核内。正常对照组大鼠下丘脑内无c fos表达阳性细胞 ,其余各组下丘脑内均有不同程度c fos的表达(图 1) ,以室旁核最为密集 ,说明应激可以诱导下丘脑室旁核c fos的表达。帕罗西汀单次、连续 6d给药可减少束缚应激大鼠下丘脑室旁核c fos表达阳性细胞神经元的数目 ,和束缚应激组比较明显下降(P <0 .0 5 ) ,说明帕罗西汀对束缚应激引起的下丘脑c fos表达有下调作用。帕罗西汀连续 6d给药比单次给药对束缚应激大鼠下丘脑c fos表达下调作用更明显 (P <0 .0 5 ,表 1)。表 1 帕罗西汀对应激大鼠血浆皮质醇和下丘脑fos样免疫阳性神经元数量的影响 (x±s,n =8) 组别
血浆皮质醇 μg·L- 1fos阳性细胞百分率 %正常对照组 36± 3-束缚应激组 5 3± 6 b 6 1.4± 4 .1单次给药束缚应激组 4 8± 4 be 2 9.4± 2 .8e连续给药 6d束缚应激组 4 1± 4 beh 11.5± 1.4 eh与正常对照组比较bP <0 .0 5 ;与束缚应激组比较eP <0 .0 5 ;与单次给药束缚应激组比较hP <0 .0 5图 1 帕罗西汀对应激大鼠下丘脑fos样免疫阳性神经元数量的影响A :正常对照组 ;B :束缚应激组 ;C :一次给药应激组 ;D :连续给药应激组3 讨论心理应激发生时 ,首先作用于大脑改变脑的内分泌机能 ,其中最重要的途径是下丘脑垂体肾上腺轴 (HPA轴 )被激活。下丘脑为间脑前臂 ,可以接受末端信息 ,又能调节交感神经系统和神经内分泌功能 ,室旁核 (PVN)是下丘脑重要的核团之一 ,有纤维投射到垂体后叶控制促皮质激素 (CRH)释放激素等神经肽分泌 ,进而控制皮质激素释放激素 (ACTH)的分泌 ,不仅启动HPA轴 ,而且影响与应激有关的行为、神经内分泌免疫活动 ,并与蓝斑去甲肾上腺素以及其他神经内分泌机制构成应激系统<4> 。糖皮质激素是HPA轴的终末产物 ,因此常作为研究应激的最经典、最重要的指标之一。本研究结果表明 ,心理应激大鼠HPA轴功能亢进 ,而帕罗西汀可降低其血浆皮质醇含量 ,从而抑制心理应激大鼠HPA轴的兴奋性。大多数细胞中均含有c fos基因 ,正常情况下可微弱表达 ,基础值很低 ,神经元细胞内c fos基因被各种生理、心理和病理等外源性或内源性的刺激所诱导 ,发生迅速、短暂高水平的表达 ,这样就将外界信号转变为基因表达 ,引起长时程的反应 ,因其具有信号传递特征 ,即表达后的蛋白因子核内磷酸化蛋白 (fos)生物活性有类似的第二信使的作用 ,所以又被称为第三信使<5> 。许多研究表明 ,存在空泡性损害的神经元中检测到c fos蛋白的合成 ,c fos蛋白表达的区域表明该部位存在不同程度的神经元损害<6,7> 。c fos可作为神经损害、情感和行为改变的标志物<7> 。本实验心理应激大鼠下丘脑室旁核c fos表达阳性神经元数目明显增多 ,说明此部位是神经损害的相关区域 ,很可能与心理应激引起的焦虑症状相关。本研究在单次和连续给药过程中 ,发现帕罗西汀能减少心理应激大鼠下丘脑室旁核c fos表达 ,神经元损害亦明显减轻 ,而且连续给药对c fos表达的下调更明显 ,表明c fos表达的减少可能是帕罗西汀抗焦虑的中枢作用机制之一。以上研究结果还表明 ,帕罗西汀通过抑制c fos基因表达 ,下调HPA轴水平 ,从而发挥中枢应激调节作用 ;通过确定不同脑区c fos的表达 ,可以探索在心理应激反应中 ,哪些脑区或神经元参加了心理应激反应 ,并可作为抗焦虑药物中枢作用区域的标志物。帕罗西汀对心理应激大鼠下丘脑室旁核c-fos表达的影响@黄欢捷$温州医学院附属一院神经内科
@邵蓓$温州医学院附属一院神经内科
@郑荣远$温州医学院附属一院神经内科
@李剑敏$温州医学院附属一院病理科
@颜志钦$温州医学院附属三院神经内科
@谢丽薇$温州医学院附属三院附属二院病理科!温州325000,浙江
@王宗敏$温州医学院附属三院附属二院病理科!温州325000,浙江帕罗西汀;;心理应激;;cfos;;皮质醇,下丘脑;;室旁核目的:观察帕罗西汀对心理应激大鼠下丘脑c fos表
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