光叶合欢系豆科含羞草亚科合欢属植物 ,学名AlbizalucidiorNielsen .<1 > 。中药合欢皮系同属植物合欢AlbiziajulibrissinDurazz .的干燥树皮 ,具有解郁、和血、宁心、消痈肿的功效 ,用于治疗心神不安、忧郁失眠、肺痈、痈肿、瘰疬等<2 > 。合欢的花和花蕾也分别用作中药 ,具有与合欢皮类似的功用<2 > 。现代研究表明中药合欢皮具有抗癌、抗生育、增强免疫等多种药理作用<3> 。同属大叶合欢、驱虫合欢、铁锈合欢、托叶合欢等多种植物的化学及生物学研究也有较多报道<3> 。光叶合欢未作药用 ,也未见有关研究报道。本文作者在筛选植物材料抗癌活性的过程中<4,5> 发现光叶合欢提取物具有很强的细胞凋亡诱导活性 ,遂对其活性成分进行了研究。本文采用跟踪活性分离的研究模式 ,从光叶合欢中分离得到 4个活性成分 ,并分别鉴定为布木柴胺K<( - ) budmunchiamineK><6> ( 1 )、( + ) 9 去甲布木柴胺K <( + ) normethylbudmunchi amineK><7> ( 2 )、邻苯二甲酸二丁酯
<8> ( 3)和邻苯二甲酸二 ( 2 乙基 己基 )酯 <9> ( 4 )。同时 ,还分离鉴定了一个甾醇类化合物 β 谷甾醇( 5 )。活性试验表明 ,化合物 1～ 4显著诱导K5 62细胞发生凋亡 ,在低浓度时还将细胞周期抑制在G0 /G1期。化合物 1～ 5均为首次从该植物中分离得到 ,其中 1～ 4为该植物活性成分的首例报道 ,2为新化合物。1 实验部分熔点用XT4型双目体视显微熔点测试仪 (泰克仪器有限公司 ,北京 )测定 ,温度未校正。比旋度用JSASCOP - 1 0 2 0型旋光仪测定。质谱用EsquireLC型质谱仪测定。紫外光谱用ShimadzuUV2 5 0 1PC型紫外分光光度计测定。红外光谱用NicoletMagna -IRTM 5 5 0型红外光谱仪测定 ,KBr压片。核磁共振谱用JEOLEclips - 60 0型超导核磁共振仪测定。薄层色谱采用青岛海洋化工集团公司产硅胶G薄层板 ( 2 0cm× 2 0cm× 0 2 5mm)和自制薄层硅胶GF2 54(青岛海洋化工集团公司 )板 ( 2 5cm×7 5cm或 2 0cm× 2 0cm)。薄层斑点采用紫外线( 2 5 4nm或 360nm)照射和 1mol·L- 1 H2 SO4溶液喷洒加热检测。减压柱色谱和柱色谱分别采用硅胶 60H (青岛海洋化工集团公司 )和SephadexLH 2 0 (Pharmacia)等填料。胎牛血清 (FBS)为Hyclone公司产品(Cat No STF72 1 )。RPMI 1 640细胞培养基为Gibcobrld公司产品。碘化丙啶 (PI)为Sigma公司产品。流式细胞术采用EPICS XL型流式细胞仪 (CoulterCo ,Hialeah ,FL ,U S A )。细胞增殖抑制活性采用美国MD公司SPECTRAMAXPlus型酶标仪。光叶合欢于 1 998年 8～ 9月采自云南 ,原植物标本现存于沈阳药科大学。1 1 活性部位的快速确定取两份光叶合欢的干燥茎粉末 2 g ,分别用质量分数为 60 %和 95 %的乙醇溶液各 5mL室温浸提 3次 ,浸提液减压浓缩 ,得 60 % (w)乙醇提取物 61mg和 95 % (w)乙醇提取物 71mg。流式细胞术活性测试结果表明 ,5 0 μg·mL- 1 的 95 %(w)乙醇提取物使受试K5 62细胞几乎全部发生凋亡 ,而同浓度的 60 % (w)乙醇提取物则几乎没有活性。取 95 % (w)乙醇提取物 5 2 4mg ,依次用石油醚 (bp 69～ 90℃ )、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇各4mL超声提取 ,分别得到石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇提取物 1 5mg、7 8mg、0 6mg和42 4mg。流式细胞术活性测试结果表明 ,在5 0 μg·mL- 1 质量浓度下 ,氯仿提取物使受试K5 62细胞几乎全部发生凋亡 ,正丁醇提取物亦使大部分细胞发生凋亡 ,而其余提取物则无活性。因此 ,确定氯仿提取物和正丁醇提取物为光叶合欢 95 % (w)乙醇提取物的主要活性部位。1 2 活性部位的大量制备与活性跟踪分离取光叶合欢的干燥茎粉末 5kg ,用 95 % (w)的乙醇室温浸提 ( 8L× 5 ) ,每次浸泡 3d。合并浸提液 ,减压浓缩干燥 ,得粗提物 363g。将该粗提物依次用氯仿、乙酸乙酯和正丁醇超声提取 ( 2L×5 ) ,分别合并、浓缩提取液 ,得到氯仿提取物 76g、正丁醇提取物 2 81 g。本文对氯仿提取物的活性成分进行了研究。取氯仿提取物 76g ,用适量氯仿溶解 ,干法上减压硅胶柱 ,用氯仿 甲醇 (V∶V =99∶1→ 90∶1 0 )混合溶剂梯度洗脱 ,经薄层检测合并 ,得到组分Ⅰ( 1 1 4g)、Ⅱ ( 5 4g)、Ⅲ ( 30 g)、Ⅳ ( 5 8g)、Ⅴ( 1 4 3g)。流式细胞术活性测试结果表明 ,组分Ⅳ在 5 0 μg·mL- 1 时使受试K5 62细胞几乎全部发生凋亡 ,代表了氯仿提取物的原活性 ,组分Ⅱ则在相同浓度下显示了新的细胞周期G0 /G1期抑制活性 ,而其余组分即使在 1 0 0 μg·mL- 1 质量浓度下也未显示活性。取组分Ⅱ 5 4g ,用适量氯仿溶解 ,干法上减压硅胶柱 ,用bp 60～ 90℃石油醚 丙酮 (V∶V =1 0 0∶0→ 0∶1 0 0 )混合溶剂梯度洗脱 ,经薄层检测合并 ,得到组分Fr Ⅰ ( 2 7g)、Fr Ⅱ ( 0 7g)、Fr Ⅲ( 1 9g)。组分Fr Ⅲ在后处理过程中析出较多粗晶 ,滤取结晶得到化合物 5的粗品 90mg。取细胞凋亡诱导活性组分Ⅳ 5 8g ,用适量氯仿溶解 ,上SephadexLH 2 0柱 ,并用氯仿洗脱。依次收集各流份 ,经薄层检测合并 ,得到组分A( 0 8g)、B( 3 4g)、C( 1 3g)。其中 ,组分B为含有化合物 1～ 4的细胞凋亡诱导活性组分 ,组分A和C均无活性。1 3 化合物 1～ 5的纯化精制取化合物 5粗品 90mg ,从氯仿中反复重结晶 ,得到纯品 5的白色针状结晶 60mg。组分B用适量氯仿溶解 ,干法上减压硅胶柱 ,用乙酸乙酯 二乙胺梯度洗脱 ,收集各流份并经薄层检测合并 ,得到活性组分B Ⅱ和B Ⅲ。组分B Ⅱ和B Ⅲ分别经制备薄层色谱分离并经SephadexLH 2 0小柱 (CHCl3)精制 ,从组分B Ⅱ中得到化合物 1 ( 5 0mg)和 2 ( 2 1mg) ,从组分B Ⅲ中得到化合物 3( 1 8mg)和 4( 1 9mg)。1 4 活性测试方法人慢性髓性白血病K5 62细胞用含 1 0 % ( φ)FBS的RPMI 1 640培养基 ,在 37℃、通入 5 %( φ)二氧化碳的培养箱中继代培养。取对数生长期的K5 62细胞 ,用新鲜RPMI 1 640培养基配制成细胞密度为 2× 1 0 5·mL- 1 的细胞悬液 ,接种于 2 4孔板中 ,每孔 0 5mL。在37℃培养 4h后 ,每孔加入样品液 5 μL ,继续培养 2 4h。药物处理后的细胞直接于倒置显微镜下观察细胞形态学变化 ,离心收集细胞 ,PBS洗涤并经PI染色后 ,通过流式细胞仪测定细胞中DNA的含量分布<4,5> 。细胞周期各时相中细胞的分布情况采用库尔特公司的WinCycle软件进行分析。细胞增殖抑制活性按文献 <1 0 >中SRB法取对数生长期的K5 62细胞进行测试。2 结果2 1 结构鉴定化合物 1 :淡黄色油状物 (氯仿 ) ,<α>30D -1 0 5°(c 2 0 ,CHCl3) ,Dragendorff试剂反应阳性 ,表明为生物碱。正、负离子ESI MSm/z分别在5 0 9+和 5 0 7- 处给出伪分子离子峰 ,综合1 3C NMR和1 H NMR数据 ,确定其分子式为C31 H76N4O。IR光谱有酰胺 ( 330 5、1 646cm- 1 )和甲基 ( 2 92 5、1 374cm- 1 )吸收。1 H NMR谱高场区的特征性甲基氢信号δ 0 89和δ 2 1 9、2 2 4、2 30提示分子中有一个sec CH3和 3个N CH3,其余则为CH2 和CH氢信号。与此相应 ,经DEPT谱分析的1 3C NMR谱显示有 1个酰胺羰基、4个甲基、1个次甲基 (C 4)和 1 5个亚甲基碳信号。最终根据PFG 1 H 1 HCOSY、PFGHMQC及PFGHMBC谱解析结果 ,将化合物 1鉴定为( - ) 布木柴胺K<( - ) budmunchiamineK><6> 。化合物 2 :淡黄色油状物 (氯仿 ) ,<α>30D + 3 6(c 1 0 ,CHCl3) ,Dragendorff试剂反应阳性 ,表明为生物碱。负离子ESI MSm/z在 493- 处给出伪分子离子峰 ,综合1 3C NMR和1 H NMR数据 ,推定分子式为C30 H62 N4O ,其分子组成比化合物 1少了CH2 。IR光谱的特征性官能团吸收与化合物 1一致 ,表明分子中也有酰胺和甲基等官能团。1 H NMR及1 3C NMR谱除了比化合物 1少一个氮甲基信号外与 1非常相
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