多肽具有分子量小、受体专一性强、易于合成和修饰、免疫反应少、容易穿透组织和血液清除快等特性 ,近年来多肽介导的核素靶向治疗研究受到了极大的关注。几乎所有神经内分泌肿瘤、消化系统肿瘤以及部分乳腺癌和肺癌都表达有高密度的生长抑素受体(SSTR) ,奥曲肽是人工合成的一种生长抑素 (SMS)类似物 ,可以与SSTR特异性结合从而抑制肿瘤细胞的增殖<1> 。将放射性核素188Re标记到奥曲肽可以使188Re特异性的分布于肿瘤部位 ,利用其发出的 β射线杀伤肿瘤细胞。较大剂量的奥曲肽增加了非特异性结合从而增加了188Re对非靶组织的杀伤作用<2 > ,将188Re标记到小剂量的奥曲肽上 ,并观察其在正常小鼠体内的分布 ,为188Re 奥曲肽应用于肿瘤的治疗打下了坚实的基础。材料与方法1.材料 :奥曲肽 (瑞典诺华制药 ) ,SnCl2 ·2H2 O由森科 (南京 )医药提供 ,其他试剂均为分析纯 ,188W 188Re发生器 (上海科兴药业 ) ,γ放射免疫计数仪 (合肥中佳公司 ) ,电子分析天平 (北京塞多利斯公司 ) ,CRC 15R活度计 (Capintec公司 ) ,Delta32 0pH计 (上海梅特勒 托利多公司 ) ,MM 1微型振荡器 (上海精密生化仪器厂 ) ,HawkeyeSPECT(美国GE公司 )。2 .标记方法 :在室温条件下 ,反应试管中依次加入葡庚糖酸钠 (0 .3mmol/L) 0 .1ml、0 .1mol/L盐酸溶解的SnCl2 ·2H2 O(16g/L) 0 .0 5ml、乙酸缓冲液 (pH =5 )0 .1ml和奥曲肽 (0 .1g/L) 0 .1ml,在充N2 、振荡的条件下反应 1h ,加入新鲜188Re淋洗液 0 .1ml,10 0℃水浴 30min ,室温下冷却 ,于 0、1、2、3和 2 4h分别测定188Re 奥曲肽的标记率。分别改变标记条件中的某一项 :(1)SnCl2 ·2H2 O的浓度分别为 1、2、4、8、16和32 g/L ,体积为0 .0 5ml。 (2 )奥曲肽的用量分别为0 .1、0 .2和 0 .3ml(0 .1g/L)。 (3)乙酸缓冲液的pH值从 4 .0至 6 .0。(4 )反应分别在室温、6 0、80和 10 0℃水浴下进行。 (5 )淋洗液体积从 0 .0 5至 0 .2 0ml。3.标记率的测定 :将新华 1号层析纸切成 1.5cm× 15cm的纸条 ,以 0 .9%的生理盐水为展开剂 ,188Re 奥曲肽和胶体的Rf =0 ,188ReO4 - 的Rf =0 .7。新华 1号纸条经 2 %的人血清白蛋白浸泡后自然晾干 ,置于110℃的烤箱 1h ,以 85 %的酸化乙醇 (pH =5 )为展开剂 ,胶体的Rf =0 ,188Re 奥曲肽及188ReO4 - 的Rf =0 .7。188Re 奥曲肽的标记率 =(188Re 奥曲肽和胶体的放射性计数率值 胶体的放射性计数率值 ) /(188Re 奥曲肽和胶体的放射性计数率值 + 188ReO4 - 的放射性计数率值 )× 10 0 %。4 .188Re 奥曲肽在小鼠体内的生物学分布 :昆明种雄性小鼠 2 5只 ,体重 19～ 2 1g ,随机分为 5组 ,每组 5只。尾静脉注射188Re
奥曲肽 7.4MBq(0 .2ml) ,分别于注射后 0 .5、1、2、4和 2 4h进行SPECT显像后处死 ,取血及主要脏器测定放射性计数率值 ,经放射性衰变校正后计算每克组织的百分注射剂量率 (%ID/g)。5 .统计学方法 :数据采用均数±标准差 ( x±s)表示 ,采用t检验。结果1.SnCl2 ·2H2 O用量对标记率的影响 :如图 1所示 ,当SnCl2 · 2H2 O的用量低于 4 0 0 μg时标记率<4 0 %。SnCl2 ·2H2 O的用量为 80 0 μg时标记率为(95 .3± 1.8) % ,当用量为 1.6mg时标记率为(85 .2±3.6 ) % ,两者差异有统计学意义 (t =5 .6 11,P <0 .0 1)。图 1 氯化亚锡用量对标记率的影响2 .奥曲肽用量对标记率的影响 :奥曲肽的用量分为 10、2 0和 30 μg ,它们的标记率分别为(95 .3±1.8) %、(95 .5± 1.5 ) %和 (91.0± 1.3) %。其中 10 μg组与 2 0 μg组比较差异无统计学意义 (t =0 .0 18,P >0 .0 5 ) ,10 μg组与 30 μg组比较差异有统计学意义(t=3.2 6 3,P <0 .0 5 )。3.pH值对标记率的影响 :标记体系的 pH值分为5组 :4 .0、4 .5、5 .0、5 .5和 6 .0。pH值对标记率的影响见图 2 ,当 pH值为 5时 ,标记率最高 ,pH值小于 5时随着 pH值的减小标记率明显下降 ,pH值大于 5时标记率呈逐步下降趋势。图 2 pH值对标记率的影响4 .淋洗液体积对标记率的影响 :新鲜188Re淋洗液的体积分为 0 .0 5、0 .10、0 .15和 0 .2 0ml,标记率的变化见图 3所示。图中可见当淋洗液体积为 0 .0 5至 0 .10ml时有较高的标记率 ,大于 0 .15ml时标记率则明显下降。5 .反应温度对标记率及标记物体外稳定性的影响 :将反应温度分别设为室温、6 0、80和 10 0℃ ,达到最高标记率所需反应时间分别为 3、2 .5、1和 0 .5h ,但所测得的最高标记率差异无统计学意义 ,在上述各种反应温度下所得到的标记物的 2 4h时放化纯分别为(16 .0± 1.9)、(6 8.0± 2 .3)、(78.0± 2 .1)和 (89.6±2 .5 ) %。图 3 淋洗液体积对标记率的影响6 .188Re 奥曲肽在小鼠体内各脏器中的分布 :由表1可知188Re 奥曲肽的肝脏摄取在 0 .5h达到高峰 ,肾脏摄取在 2h达高峰 ,小肠和大肠摄取分别在 1h和 2h达到最大 ,2 4h时肠道放射性得到明显的清除。小鼠的SPECT显像与表 1中肝肾放射性动态分布相符合。表 1 188Re 奥曲肽在正常小鼠体内的分布 (% ,ID/g)组织器官 0 .5h 1h 2h 4h 2 4h血液 2 .51 2±0 .1 2 41 .72 8±0 .1 4 21 .0 4 7±0 .1 720 .535±0 .1 0 10 .2 1 7±0 .0 96心脏 1 .861±0 .2 531 .2 4 5±0 .2 1 40 .42 1±0 .1 0 30 .352±0 .1 0 40 .1 72±0 .0 87肝脏 1 0 .52 4±0 .5386 .31 7±0 .32 55 .2 54±0 .2 874.695±0 .2 4 12 .1 78±0 .1 83脾脏 2 .1 34±0 .1 651 .968±0 .1 4 21 .1 2 3±0 .1 1 20 .563±0 .0 850 .2 59±0 .0 78肺脏 2 .0 1 4±0 .1 721 .61 2±0 .1 321 .2 0 5±0 .1 0 80 .856±0 .0 840 .61 7±0 .0 73肾脏 5 .1 61±0 .2 1 44 .987±0 .2 1 39.1 85±0 .4454 .1 56±0 .2 1 21 .81 1±0 .1 1 7胃 4 .2 57±0 .1 963 .62 8±0 .1 534 .2 31±0 .1 1 35 .1 0 1±0 .51 21 .0 1 4±0 .0 87小肠 2 .1 36±0 .1 2 51 6 .2 1 4±0 .1 4 71 4 .2 87±0 .41 73 .359±0 .1 821 .42 4±0 .0 91大肠 0 .0 98±0 .0 1 41 .0 0 1±0 .0 651 5 .72 5±0 .52 18.659±0 .32 11 .962±0 .1 32讨论188Re标记奥曲肽
的原理是利用还原剂打开奥曲肽分子中的二硫键并与之形成复合物 ,在还原剂作用下得到的较低价态188Re取代与奥曲肽结合的还原剂从而形成188Re 奥曲肽。188Re和99mTc具有相似的化学性质 ,但188Re的氧化还原电势比99mTc要高出 2 0 0mV ,这样188Re相对99mTc更难还原到较低的价态 ,因而高质量以及相对较高浓度的SnCl2 ·2H2 O是标记成功的关键。Faintuch等<2 > 认为SnCl2 ·2H2 O与奥曲肽质量比为 3.5时可以得到最大的标记率 ,章斌等<3> 报道两者质量比为 8时可以得到最大的标记率 ,他们所用奥曲肽分别为 2 5 0 μg和 10 0 μg。我们尝试用相近的SnCl2 ·2H2 O与奥曲肽的质量比来标记 10 μg奥曲肽时没能成功 ,直到SnCl2 ·2H2 O用量增至 80 0 μg ,SnCl2 ·2H2 O与奥曲肽质量比达到 80倍时才得到了理想的标记率。临床应用99mTc标记的奥曲肽进行受体显像诊断肿瘤时 ,奥曲肽的用量通常只有 10～ 2 0 μg左右<4 > ,大于 2 0 μg时 ,较大剂量的奥曲肽会将99mTc带到非靶器官和组织 ,使得本底偏高 ,图像模糊 ,这是由于个体差异的存在以及肿瘤表达SSTR的有限性。同样道理 ,大剂量的奥曲肽标记188Re进行核素靶向治疗时 ,也会使非靶器官和组织聚集较多的放射性核素。文献 <2 ,3>
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