研究证实槲寄生中血小板活化因子(PAF)拮抗剂有效成分为乙酸乙酯和水提取物<1>。作者对 槲寄生乙酸乙酯和水提取物行硅胶柱层析分离,并对提取的化学结晶物进行分子结构鉴定,进一步 分析槲寄生的有效成分。1材料与方法1.1材料与仪器健康志愿者,采血前2周无服药史;新西 兰白兔,体重3～4kg,由山东省实验动物中心提供。血小板聚集仪(HematTracer Ⅰ,日本);120～150目硅胶粉和硅胶柱层析均为青岛海洋化工厂产品;红外分光光度计(PerKinElmer783);核磁共振仪(FX90Q和AM500);质谱仪(MAT44S)。1.2 槲寄生PAF拮抗剂有效成分的分离、提取槲寄生生药(购自山东省中药材公司,产地辽宁省)干 燥切片,体积分数95%乙醇热回流,减压回收乙醇,得浸膏,然后以乙酸乙酯萃取,对所得槲寄 生乙酸乙酯剂和槲寄生水剂进行硅胶柱层析。以氯仿和甲醇混合溶剂梯度洗脱。氯仿与甲醇体积比 从991开始,顺次为982、973、955、937、9010、8020、 7030、6040、5050、4060、0100依次洗脱。对洗脱过程中每一比 例洗脱的组分收集液做薄层层析,合并具有相同Rf值(化合物移动距离与展开剂展开距离的比值 )的收集液,静置待结晶析出。再利用红外光谱分析、核磁共振谱分析和质谱分析进行分子结构鉴 定。采用Born比浊法<2>观察所得结晶物体外对人和兔血小板聚集功能的作用,以生理盐水 作对照。具体方法同文献<1>。1.3统计学处理采用SPSS10.0软件行F检验及SNK 分组检验,检验水准α=0.01。2结果与结论槲寄生乙酸乙酯剂经层析分离得结晶物Ⅰ、Ⅱ、 Ⅲ,槲寄生水提取物得结晶物Ⅳ、Ⅴ。结晶物Ⅳ与结晶物Ⅱ具有相同Rf值及相对分子质量,为同 一种物质。结晶物Ⅲ量少,未进一步实验。槲寄生结晶物Ⅰ、Ⅱ和Ⅴ体外对人和兔血小板聚集功能 的影响,见表1。表1槲寄生结晶物体外对血小板最大聚集率的影响%组别nPAFADP人血小 板兔血小板人血小板兔血小板对照组369.0±11.070.0±12.070.0±10. 067.0±11.0结晶物Ⅰ366.0±9.868.0±10.270.0±11.769 .0±10.9结晶物Ⅱ327.0±22.329.0±20.449.0±14.052.0 ±15.4结晶物V365.0±11.271.0±10.267.0±10.063.0±1 2.0F18.8721.617.663.71P<0.0001<0.0001<0.010 .05SNK分组检验结果表明结晶物I、V对PAF和ADP诱导的人和兔血小板聚集均无抑制 作用。结晶物Ⅱ对PAF诱导的人和兔血小板聚集有抑制作用(P<0.01),对ADP诱导的 人血小板聚集有抑制作用(P<0.01),而对ADP诱导的兔血小板聚集无抑制作用。结晶物Ⅱ经鉴定为:类白色结晶,熔点158～160℃,HClMg反应阳性,Molish反应阳性,NaBH4反应阳性,提示为二氢黄酮甙类化合物。IRvkBrmax cm-1:3406、1644、1451、1433、1272、1197、1032。EI MSm/z:464
+、446+、428+、410+、302<甙元>、301、152、150。H NMR(500MHz、DMSO d6)δ(ppm):2.73(1H,dd,J=2.6,17.0,H3,cis);3.14 (1H,dd,J=13.0,17.0,H3,trans);3.78(3H,S,OCH3 );4.94(1H,d,J=7.4表明为βD甙键);6.48(1H,dd,J=2.6,13.0,H2)。13CNMR结晶物Ⅱ(ppm)数据,碳原子编号/化学位移:1/;2/78.8;3/42.1;4 /197.0;5/162.8;6/96.5;7/165.2;8/85.4;9/162. 6;10/103.2;1′/129.1;2′/111.3;3′/147.5;4′/14 7.0;5′/115.2;6′/119.6;1″/99.7;2″/73.0;3″/77 .0;4″/69.5;5″/76.3;6″/60.6。根据以上数据与标准品高圣草素7O βD葡萄糖甙(上海化工研究所孔德云研究员惠赠)对照,推导该化合物为高圣草素7OβD葡萄 糖甙。分子式为C22H24O11,相对分子质量464,结构式见图1。图1高圣草素7Oβ D葡萄糖甙的结构式槲寄生中血小板活化因子拮抗剂有效成分的纯化及鉴定@万鼎铭$郑州大学第一附属医院血液科!郑州450052
@徐从高$山东大学齐鲁医院肿瘤中心!济南250012
@张茂宏$山东大学齐鲁医院肿瘤中心!济南250012槲寄生;;高圣草素7OβD葡萄糖甙; ;血小板活化因子;;拮抗剂;;兔目的:提纯槲寄生中血小板活化因子(PAF)拮抗剂有效活 性成分并鉴定其分子结构。方法:利用硅胶柱层析分离出槲寄生乙酸乙酯剂结晶化合物及槲寄生水 剂结晶化合物。再利用红外光谱分析、核磁共振谱分析和质谱分析进行分子结构鉴定。结果与结论 :槲寄生中的PAF拮抗剂有效活性成分是高圣草素-7-O-β-D葡萄糖甙。1万鼎铭,徐从 高,张茂宏.槲寄生不同溶剂提取物对血小板活化因子的拮抗作用观察.郑州大学学报(医学版),2005,40(3):394
2BornGV,CrossMJ.Theaggregationofbloodplatelets.J Physiol,1963,168:178博士课题
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