作者从传统抗风湿中药槲寄生中提取出一种有效活性成分,属于二氢黄酮类化合物,化学名称为高圣 草素7OβD葡萄糖甙(HG)<1>,为特异性的血小板活化因子(PAF)受体拮抗剂<2> 。近年发现PAF除了诱导血小板聚集外,还具有广泛的生物学活性,在多种病理生理过程中有重 要作用,尤其是作为前炎症介质可作用于多种炎症细胞引起炎症反应<3>。作者探讨了槲寄生中 PAF拮抗剂有效活性成分HG的抗炎机制。1材料与方法1.1材料与仪器HG由作者提纯(> 98%),用生理盐水(NS)配制为10-6mol/L溶液,4℃保存备用。PAF,Sig ma产品,以2.5g/L小牛血清白蛋白的生理盐水(BSA·NS)配制为10-6mol/L溶液,-20℃冻存备用。BN52021(银杏内酯B):由法国IHBIPSEN公司的BraquetP博士惠赠,应用NS配制为10-6mol/L溶液,4℃保存备用。HIS TOPAQUE1119及HISTOPAQUE1117,Sigma产品,密度分别为(1.1 19±0.001)g/ml和(1.117±0.001)g/ml,均避光,4℃保存备用。 100g/L的小牛血清RPMI1640营养液(FS)、ELISA试剂盒均购自美国Genzyme公司;EIA试剂盒购自美国的CaymanChemical公司。酶联免疫检测仪Bio RAD,Mi croplateReader,USA;UV754分光光度计,上海第三分析仪器厂;CO2培 养箱,美国NUAIRE公司。1.2多形核白细胞(PMN)制备<4>健康志愿者12名,静 脉无菌采血5ml,肝素抗凝后,加入等量的100g/LFS稀释,利用密度梯度离心分离PM N。再用低渗溶解红细胞方法<5>得高纯度的PMN(>99%),台盼蓝拒染试验计数活细胞 >98%,应用FS调整PMN细胞数为1×106ml-1,当日备用。1.3HG对PMN分 泌IL1β、IL6、IL8及TNFα的影响取800μlPMN悬液,对照组加入100μl NS和100μlBAS·NS;HG组加10-6mol/LHG和PAF各100μl;BN 52021组加10-6mol/LBN52021和PAF各100μl;PAF组加NS和1 0-6mol/LPAF各100μl。充分混合10min,37℃,体积分数5%CO2培养 箱中培养20h,分离上清液,-20℃冻存。应用ELISA法,按试剂盒说明书操作测定IL 1β、IL6、IL8及TNFα。每份标本均设3组平行管,取平均值,单位为ng/L。1. 4HG对PMN分泌白三烯B4(LTB4)的影响取40μlPMN悬液,对照组加入NS和B AS·NS各5μl;HG组加10-6mol/LHG和PAF各5μl;BN52021组加 10-6mol/LBN52021和PAF各5μl;PAF组加NS和10-6mol/LP AF各5μl。充分混合10min分离上清液,立即按照EIA试剂盒说明书操作测定LTB4 。每份标本均设3组平行管,取平均值,单位为ng/L。1.5统计学处理数据以x±s表示, 采用SPSS10.0软件行方差分析与t检验,检验水准α=0.01。2结果各组炎症细胞因 子IL1β、IL6、IL8、TNFα及LTB4水平,见表1。从表1可以看出,各组间炎症 细胞因子IL1β、IL6及IL8水平差异无统计学意义(P>0.05)。SNK分组检验结 果表明,PAF组与BN52021组TNFα水平同对照组比较,差异有统计学意义(P<0. 05),而HG组TNFα水平同对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。PAF组、 HG组及BN52021组LTB4水平同对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。表 1各组炎症细胞因子IL1β、IL6、IL8、TNFα及LTB4的水平(n=12)ng/ L组别IL1βIL6IL8TNFαLTB4对照组37.35±1.8531.25±1.8 7107.97±117.6620.08±3.502.24±0.10HG36.72±0. 9131.29±1.48107.73±132.1723.34±3.198.33±1.5 3BN5202137.56±1.8632.75±1.25151.38±119.7026 .45±3.466.80±0.17PAF36.67±1.2331.05±1.10166 .78±128.9727.48±2.989.33±0.70F1.002.490.701 2.37113.14P0.380.150.55<0.001<0.00013讨论炎症是在 致炎因素作用下,由炎症细胞及其释放的炎症介质引起的一系列病理生理过程。炎症既有保护机体 的功能,又有损伤组织及相应器官的两面性。PAF作为一种炎症介质可引起多种生物学效应<6 ,7>,一方面激活炎症细胞释放IL1、IL6、IL8、LTB4、TNF、超氧自由基及其 自身,另一方面这些炎症介质又反过来作用于炎症细胞及炎症介质,由此相互诱生形成炎症级联的 正反馈网络<8～10>。PAF受体拮抗剂可以阻抑这种反馈从而改善和(或)减轻炎症的程度 ,保护机体免遭激烈炎症的损害<11,12>。PMN是体内一种主要炎症细胞,PMN在致炎 因子刺激下可产生IL1、IL6、IL8、LTB4、TNF及PAF<6>。作者以国际公认 的PAF受体拮抗剂BN52021为对照,探讨HG对PAF介导的PMN产生炎症介质的影响 。结果显示,10-6mol/L的PAF、HG及BN52021对PMN产生IL1β、IL 6及IL8均无影响,说明PAF不能直接刺激PMN释放IL1β、IL6及IL8,PAF受 体拮抗剂HG、BN52021不影响IL1β、IL6及IL8释放。PAF可刺激PMN产生 炎症介质TNFα及LTB4,HG能完全抑制PAF所致的PMN的TNFα释放,BN520 21能部分抑制PAF所致的PMN的TNFα释放。HG及BN52021能部分抑制PAF所 致的PMN释放LTB4,2者抑制作用基本相同。综上所述,槲寄生的抗炎机制可能是HG抑制 PAF刺激炎症细胞产生炎症介质。槲寄生具有较强抗炎作用及抑制血小板聚集功能,因而具有广阔的药用开发前景。高圣草素-7-O-β-D-葡萄糖甙体外对多形核白细胞分泌炎症介质的影响@万鼎铭$郑州大学第一附属医院血液科!郑州450052
@徐从高$山东大学齐鲁医院肿瘤中心!济南250012
@张茂宏$山东大学齐鲁医院肿瘤中心!济南250012高圣草素-7-O-β-D-葡萄糖甙; ;炎症介质;;多形核白细胞;;IL-1β;;IL-6;;IL-8;;TNF-α;;白三 烯B4目的:探讨高圣草素7OβD葡萄糖甙(HG)体外对多形核白细胞分泌炎症介质的影响。 方法:利用HG预处理人体主要的炎症细胞多形核白细胞(PMN),测定PAF刺激下PMN产 生的炎症介质IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α和白三烯B4(LTB4)。结果: PAF可刺激PMN产生炎症介质TNFα、LTB4;HG能完全抑制PAF所致的PMN产生 TNF-α,HG能部分抑制PAF所致的PMN产生LTB4;PAF和HG均对PMN产生I L-1β、IL-6及IL-8无影响。结论:HG作为PAF拮抗剂,可抑制炎症介质产生而发 挥抗炎作用。1万鼎铭,徐从高,张茂宏.槲寄生中血小板活化因子拮抗剂有效成分的纯化及鉴定.郑州大学学报(医学版),2005,40(3):396
2万鼎铭,徐从高,张茂宏.高圣草素7OβD葡萄糖甙抗血小板活化因子的竞争抑制实验.郑州大学学报(医学版),2005,40(3):398
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