人巨细胞病毒(humancytomegalovirus,HCMV)广泛存在于人体,不仅是 人类先天感染的主要病原之一,同时也是机体免疫功能低下人群如器官移植及AIDS患者并发感 染死亡的常见原因之一<1>。目前更昔洛韦(GCV)是治疗HCMV感染的一线药物,但临床 应用至今尚不能达到满意的疗效。中药金叶败毒制剂(JYBD)是由金银花、大青叶、鱼腥草及蒲公英提取后按一定比例混合组成的纯中药制剂,具有抗HCMV作用<1>。作者采用RTPCR法测定GCV或JYBD作用后,体外感染HCMV的人胚肺细胞(HEL)中HCMN即刻 早期基因IE86mRNA的表达,并测定受染细胞TNFα、IL6的分泌量,以评价2者抗H CMV的效果,为临床应用提供理论依据。1材料与方法1.1材料①药物:JYBD由本院中西 医结合研究所制,批号20011231,每ml含生药1g。GCV购自湖北省科益药业公司, 50mg/支,批号20021020。②细胞与病毒:HEL细胞由本室保存,按常规方法培养 传代,以第10代HEL为实验材料。HCMVAD169株由湖北省病毒研究所提供,按常规方 法传代、滴定,滴度为10-3.36TCID50/0.1ml。③试剂及仪器:Trizol及高糖DMEM为Gibco产品,RTPCR试剂盒为MBI产品,IL6和TNFα放射免疫试剂盒为解放军总医院东亚免疫技术研究所 产品。1.2实验分组参照文献<1>制备感染HCMV的HEL,分3组培养。病毒对照组换维 持液(含体积分数3%小牛血清的DMEM)继续培养。JYBD组:以维持液稀释的JYBD继 续培养,终浓度4g/L;GCV组:以维持液稀释的GCV继续培养,终浓度25mg/L。1 .3观测指标1.3.1细胞病变情况:低倍镜下细胞变大变圆,出现鹰眼样改变为病变细胞。分 别记录感染后24h、48h、72h、96h、120h、144h、168h细胞病变程度。 无明显病变“-”;<25%细胞病变为“+”;25%～细胞病变为“”;50%～细胞病变为“”;≥75%细胞发生病变为“”。1.3.2IE86mRNA的RTPCR检测:IE86基因引物序列由北京三博公司合成,扩增片断425bp,分别位于UL12 2基因第5外显子上83和508碱基上,上游引物5'CGGCTGTATCGTGATCTC TG3',下游引物5'GCACCTTCTCGTTGTCCAAC3';βactin为内参照,扩增片断542bp,上游引物5'TGGAATCCTGTGGCATCCATGAAAC3',下游引物5'TAAAACGCAGCTCAG TAACAGTCCG3'。采用Trizol试剂盒一步法于感染6h、12h、24h、48h、72h、96h后提取HEL的总RNA,行RT PCR,具体操作同文献<1>。取反应产物10μl点样于20g/L琼脂糖凝胶上85V电泳3 0min,在MPLAS1000型医学彩色图像分析系统上进行吸光度扫描分析。以IE86m RNA扩增条带与βactin扩增条带的扫描峰面积比表示IE86mRNA的相对表达水平。 每组重复16次。1.3.3受染细胞TNFα、IL6分泌量测定:分别于感染后12h、24 h、48h、72h和96h收集维持液,-20℃保存,依试剂盒说明测定TNFα和IL6水 平。每组重复16次。1.4统计学处理应用SSPS10.0软件对数据行重复测量数据的方差 分析,检验水准α=0.05。2结果2.1各组HEL感染不同时间细胞病变程度病毒对照组于 感染48h出现细胞病变,且病变程度随感染时间的延长而加重。而JYBD和GCV组则在72 h才出现细胞病变,且进展缓慢。见表1。表1各组HEL感染不同时间细胞病变程度组别24h 48h72h96h120h144h168h病毒对照-++JYBD--+++GCV--± +++±:可疑病变2.2各组HELIE86mRNA检测结果见表2。2.3各组HEL细胞 因子分泌情况见表3。表2各组HELIE86mRNA的表达水平(n=16)组别6h12h 24h48h72h96h病毒对照0.37±0.070.41±0.020.60±0.08 0.88±0.121.41±0.171.03±0.14JYBD0.33±0.060.3 5±0.030.42±0.070.57±0.100.86±0.11#0.78±0.70 GCV0.35±0.050.33±0.060.58±0.050.73±0.081.30 ±0.070.96±0.05与病毒对照组比较,P<0.05,#P<0.01表3各组HC MV感染的HEL细胞TNFα及IL6的分泌量ng/L组别TNFαIL612h24h48 h72h96h12h24h48h72h96h病毒对照0.45±0.050.82±0.0 80.91±0.081.05±0.101.10±0.1124.61±3.2230.12 ±4.5853.60±6.3465.10±7.2271.71±7.84JYBD0.64 ±0.66△1.03±0.10#□1.24±0.10#□1.27±0.12△1.29± 0.14△27.35±3.0337.26±4.29△70.61±7.31#□79.43 ±8.71△83.31±9.23△GCV0.55±0.060.83±0.890.99± 0.101.08±0.111.17±0.0925.12±2.8431.56±5.935 6.28±5.9566.58±7.3573.76±8.59与病毒对照组比较,P<0.0 5,#P<0.01;与GCV组比较,△P<0.05,□P<0.013讨论HCMV可广泛 感染人类,虽然大多感染者无症状,但在先天感染和免疫抑制个体可引起严重后果。由于HCMV 结构复杂,至今尚未研制出安全有效的疫苗,因此药物治疗HCMV感染性疾病仍是目前研究的重 点。GCV具有强大的抗HCMV作用,被认为是最有效的抗HCMV药物,但长期应用易产生毒 性,并诱发耐药毒株<2>,尤其不宜孕期应用。本实验结果显示JYBD与GCV在体外细胞水平均能有效抑制HCMV感染所致的细胞病变,JYBD作用稍弱。定量RTPCR检测结果显示,HCMV感染后6h即可于HEL中检测出IE86mRNA,随感染时间的 延长,IE86mRNA表达水平逐渐增高,48～72h达高峰,感染后96h仍维持较高水平 。用药后JYBD组IE86mRNA表达水平明显降低,以72h作用最明显(P<0.01) ,GCV组无明显变化(P>0.05)。提示JYBD可抑制HCMVIE86mRNA的转录,而GCV无此作用。GCV主要是通过抑制HCMVDNA聚合酶的合成抑制HCMV的复制。IE86基因为HCMV主要即刻早期基因,其基因产物 IE86蛋白能够抑制HCMVIE基因增强子的激活,对自身起负调控作用,可促进HCMV早 期基因和晚期基因的启动子,激活DNA多聚酶和RNA多聚酶Ⅱ,或作为早期基因和晚期基因的 增强子,对其产生正调控作用<3>,同时IE86可反式作用于宿主细胞基因,影响宿主细胞的 生长调控,创造有利于病毒增殖的细胞内环境<4>。本研究结果表明JYBD可增加受染细胞的 细胞因子分泌,调节受感染细胞的免疫状态。因此JYBD可通过抑制HCMVIE基因的转录, 抑制病毒感染宿主细胞后的一系列级联反应从而干扰病毒的复制,抑制细胞病变的发展。综上所述 ,JYBD能明显抑制HCMV引起的细胞病变及HCMVIE86mRNA的转录,表现出与G CV相似的抗HCMV能力,是治疗HCMV感染的理想药物。中药金叶败毒制剂体外抗人巨细胞病毒作用观察@张$华中科技大学同济医学院附属同济医院妇产科!武汉430030
@谭丽$郑州大学第二附属医院妇产科!郑州450014
@闻良珍$华中科技大学同济医学院附属同济医院妇产科!武汉430030中药;;人巨细胞病毒 ;;聚合酶链反应;;IE86;;TNF-α;;I-L6目的:研究中药金叶败毒制剂(JY BD)抗人巨细胞病毒(HCMV)感染的可能机制。方法:采用体外细胞培养技术建立HCMV 感染细胞模型,应用更昔洛韦(GCV)和JYBD进行干预,采用定量RT-PCR法检测干预 后不同时间感染细胞HCMV即刻早期基因IE86mRNA的表达水平,观察感染细胞的病变进 展情况,同时采用放射免疫法测定受染细胞细胞因子TNF-α和IL-6的分泌水平。结果:J YBD与GCV对HCMVIE86mRNA的表达以及HCMV所致细胞病变有明显的抑制作用 ,降低受染细胞TNF-α、IL-6的分泌水平,JYBD作用弱于GCV。结论:JYBD可 通过抑制HCMVIE基因的转录,促进细胞因子的分泌而发挥体外抗HCMV作用。1张,周 舫,闻良珍.更昔洛韦联合中药金叶败毒制剂体外抗人巨细胞病毒作用观察.郑州大学学报(医学版),2005,40(2):254
2DrewWL.Clinicaluseofganciclovirforcytomegalovirusin fectionandthedevelopmentofdrugresistance.JAcquirIm muneDeficSyndr,1991,4(Suppl1):S42
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4SpeirE,YuZX,FerransKW,etal.Aspirinattenuatescyto megalovirusinfectivityandgeneexpressionmediatedbycy
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