对从泥蚶Tegillarca granosa(Linnae-us)中提取的生物活性物质-海生素的初步研究,证明其具有明 显的抗肿瘤作用。为了更好地开发和利用该海洋生物活性蛋白,我们制备了海生素冻干粉并对该制剂的质量标准进行了研究。1仪器与试药WatersAlliance2690高效液相色谱仪;Waters996型二极管阵列检测器;Water s2010色谱工作站;LGJ-ⅢA型医用冷冻干燥机(上海医用分析仪器厂);GQ105高 速管式离心机(上海离心机械研究所);冷凝器(上海远东制药机械总厂);电热恒温干燥箱,恒 温真空干燥箱(山东潍坊医疗器械厂);TG328A电光分析天平(上海医用激光仪器厂);p HS-2C型酸度计(上海雷磁仪器厂)。乙腈(色谱纯);鲎试剂(厦门鲎试剂厂);细菌内毒 素工作用标准品(中国生物制品所);其他试剂均为国产分析纯。海生素冻干粉由青岛海生肿瘤医 院制剂室提供(批准文号:鲁药制字Z0220030112;批号040213)。2
质量控制 2.1性状本品为黄色或淡黄色冻干粉末,有较强吸湿性。2.2鉴别(1)茚三酮反应:取本品 适量溶解,加茚三酮试液混匀加热,冷却,溶液为蓝紫色。(2)
双缩脲反应:取本品适量溶解, 加入40%NaOH溶液与1%CuSO4溶液的等量混合液3~4滴,放置2~3min,溶液 由浅蓝渐变为紫红色。2.3检查<1>pH值:取本品适量,加水制成10mg·ml-1的溶 液,测定pH值应为5.0~7.0。干燥失重:精密称取本品适量,以五氧化二磷为干燥剂,真 空减压干燥至恒重,测定减失重量应小于5%。炽灼残渣:取本品适量,按相关规定检查,炽灼残 渣不得超过12%。重金属:取本品适量,按相关规定检查,重金属含量不得超过百万分之二十五 。细菌内毒素:取本品适量,按相关规定检查,细菌内毒素不得超过500Eu·mL-1。2. 4总氮含量测定本品有效成分为小分子蛋白和多肽,故选择总氮含量作为测定指标。精密称取海生 素冻干粉50mg,按氮测定法(半微量法)测定<1>,置于100ml三角烧瓶中,加入0. 3g无水Na2SO4及30%CuSO4溶液5滴,再加入2.0mL浓硫酸,在三角烧瓶上放 一小漏斗,置电热板上加热至溶液成澄明的绿色后再加热10min,放冷。另取2%硼酸溶液1 0.0mL,置100mL三角烧瓶中,加入甲基红-溴甲酚绿混合指示剂6滴,作为接受液。消 化后的提取物加2.0mL水,并用少量水转移至定氮装置中,加入40%NaOH溶液10mL ,连接蒸馏装置,进行水蒸汽蒸馏,至接收液的总体积为70mL时,停止蒸馏,接收液用硫酸滴 定液(0.0512mol·L-1)滴定,并将结果用空白试验校正。每1mL硫酸滴定液(0 .0512mol·L-1)相当于0.1435mg氮。含量测定结果见表1。表1海生素冻干 粉氮含量测定结果批号取样量(mg)耗硫酸滴定液(mL)氮含量(mg·g-1)空白00. 30004021345.920.5563.904021453.224.0064.504 021550.922.6063.404021646.421.5066.2由以上结果可以看出,海生素冻干粉氮含量大于6.0%。3海生素冻干粉高效液相指纹图谱研究<2~6>3.1色谱条件MerckLichrospher100NH2(4.0mmI.D.×250mm;5μm)色谱柱;流动 相:乙腈:水梯度洗脱(见表2);柱温:室温;流速:1.0mL·min-1;进样量:20 μL;检测波长:254nm。表2梯度洗脱条件梯度:时间(min)A%B%0100020 35652535653.2供试品溶液的制备取海生素冻干粉适量(0.5g左右),加pH为 3.0左右的水10mL,溶解,混匀,滤过,即得。3.3样品测定方法精密吸取供试液20μ L,经微孔滤膜过滤后注入液相色谱仪,记录色谱图,计算各共有峰的相对保留时间和峰面积比值 及相对标准图1同一批次海生素冻干粉连续进样的指纹图谱偏差。同一批次连续进样指纹图谱见图 1。3.4不同批次样品指纹图谱的测定取三批样品(批号:040213,040216040 219)的供试液,按4.3方法进行指纹图测定(结果见表3~7和图2)。表3三批样品各峰 保留时间(min)对2号峰保留时间(min)的比值批号Rt1/Rt2Rt2/Rt2Rt 3/Rt2Rt4/Rt2Rt5/Rt20402130.7011.081.331.620 402130.6911.081.331.620402130.7011.081.331. 620402160.7011.081.331.620402160.7011.091.3 31.660402160.6911.081.341.660402190.6911.07 1.341.640402190.6911.081.331.640402190.6911 .081.341.66x-0.691.001.081.331.64SD0.00500. 0050.0050.019RSD%0.800.50.41.1表4三批样品色谱峰峰面积测 定结果批号123456Rt3.6496.1248.7549.45411.66314.3 6704021344.68389.5483060.97112.9911770.7273 78.304021335.098158.6062981.73458.8181650.5 45399.06104021335.419154.1353036.852407.311 1643.135416.18604021635.234140.0123134.8673 38.6781718.313450.9954021687.47595.2592864. 957124.1161702.662377.6104021650.37784.5752 898.994120.2431712.748374.07604021951.2886. 6642948.255120.4051777.316561.38604021952.3 2485.3842932.609114.9891793.66448.690402194 4.87289.0843070.345114.7651752.514478.616对照 48.529109.2522992.175212.4791724.624431.658 Rt-RSD(%)1.550.810.670.711.081.34A-RSD(%)33 .3829.082.9868.263.1314.21表5各批次单峰峰面积与2号峰峰面积 比值批号123456Rt3.6496.1248.7549.45411.66314.36 70402130.0150.0291.0000.0370.5780.124040213 0.0120.0531.0000.1540.5540.1340402130.0120. 0511.0000.1340.5410.1370402160.0110.0451.00 00.1080.5480.144402160.0310.0331.0000.0430. 5940.1320402160.0170.0291.0000.0410.5910.12 90402190.0170.0291.0000.0410.6030.190040219 0.0180.0291.0000.0390.6120.1530402190.0150. 0291.0000.0370.5710.156x-0.0160.0361.0000.0 710.5770.144SD0.0060.0100.0000.0480.0250.02 0RSD%36.50127.9010.00067.3474.36514.113表6样品 单峰面积占总峰面积的百分比批号1.0002.0003.0004.0005.0006.0 00Rt3.6496.1248.7549.45411.66314.3670402130 .0080.0160.5610.0210.3240.0690402130.0060.0 280.5250.0810.2900.0700402130.0060.0270.533 0.0720.2890.0730402160.0060.0240.5390.0580. 2950.078402160.0170.0180.5450.0240.3240.072 0402160.0100.0160.5530.0230.3270.0710402190 .0090.0160.5320.0220.3210.1010402190.0100.0 160.5400.0210.3300.0830402190.0080.0160.553 0.0210.3160.086x-0.0090.0200.5420.0380.3130 .078SD0.0030.0050.0120.0250.0170.010RSD%36. 76326.1772.17565.5165.33913.345表7三批冻干粉指纹图谱相 似度批号040213040216040219对照指纹图谱0402131.0000.99 91.0001.0000402160.9991.0001.0001.000040219 1.0001.0001.0001.000对照1.0001.0001.0001.000由 以上结果可以看出,各批次样品中均只有2个峰(8.7min峰和11.6min峰)的峰面积 大于总峰面积的20%,其峰面积RSD分别为2.18%和5.34%,其统计差值分别为-3 .1%~+3.5%和-7.7%~+5.4%,符合小于±20%的规定。其余各峰面积与总峰面积的比值均小于10%,其相对保留时间固定,相对保留时间的RSD小于2.0%,说明各批次间样品的指纹图谱一致。5讨论由海生素冻干粉形状分析,当对提取物进
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