随着抗生素的广泛应用 ,越来越多的病原菌对常用抗生素产生耐药性 ,且耐药程度日益加深 ;同时 ,由于化学合成药物开发的难度大、毒副作用明显 ,人们对从传统天然药物特别是中草药中找寻抗微生物感染的新药<1～4>越来越关注。为了进一步发现更多的具有抗感染作用的中草药 ,探索其抗菌作用的物质基础 ,笔者此次对47种中草药80 %乙醇提取物抑制大肠埃希菌、铜绿假单胞菌和白色念珠菌的活性进行了筛选研究 ,现报道如下。1材料标准菌 :
大肠埃希菌 (ATCC25922)、
铜绿假单胞菌(ATCC27853) (中国药品生物制品检定所提供 )。临床分离菌株 :大肠埃希菌 (57、95号 )、铜绿假单胞菌(57、66号 )、白色念珠菌 (44、92、66、97号 ) (从成都军区昆明总医院呼吸系统患者痰液标本中分离得到 )。抗生素药敏纸片 (中国药品生物制品检定所提供 )。
中草药 :山豆根、灵芝、赤芍、败酱草、山楂、大活血、黄药子、白花蛇舌草、茵陈、制首乌、茯苓、田基 黄、知母、钩藤、半枝莲、黄连、鸡谷草、佩兰、苏木、重楼、栀子、马齿苋、瓜子金、金钱草、 黄柏、甘草、胡黄连、桑寄生、虎杖、石榴皮、杜仲、地榆、黄芪、生大黄、贯众、荔枝核、巴戟天、楮实子、板蓝根、葛根、肉桂、爬山虎、黄芩、苦石莲、旱莲草、吴茱萸、紫花地丁(云南药材有限公司延寿堂连锁经营公司和成都军区昆明总医院中药房提供 )。M -H氏琼脂培养基 (Mueller -Hinton'sAgar)用于抗大肠埃希菌和铜绿假单胞菌试验 ;沙氏琼脂培养基(Sabouraud'sAgar)用于抗白色念珠菌试验。2方法与结果2 1耐药菌药敏测试耐药菌药敏测试按照抗生素药敏常规测试方法 (纸片法 )进行 ,结果详见表1。表12种临床分离菌株对抗生素的药敏试验结果Tab1Antibiotics susceptibilitytestresultsof2clinicalisolate dstrains菌种菌株数耐药敏感大肠埃希菌35哌拉西林、左氧氟沙星、利福霉素丁胺卡那 霉素、头孢他啶、头孢噻肟、头孢曲松、亚胺培南57头孢他啶、头孢哌酮、头孢噻肟、加替沙星 、洛美沙星、利福霉素亚胺培南95利福霉素丁胺卡那霉素、亚胺培南、哌拉西林、头孢吡肟、头 孢哌酮、头孢他啶、头孢曲松铜绿假单胞菌57头孢哌酮、头孢他啶、头孢噻肟、头孢曲松、利福 霉素、加替沙星、左氧氟沙星亚胺培南66哌拉西林、头孢哌酮、头孢噻肟、丁胺卡那霉素、利福 霉素头孢他啶、亚胺培南、环丙沙星、加替沙星、左氧氟沙星表211种中草药的抗菌活性筛选结 果Tab2Screeningresultsoftheantimicrobialacti vitiesof11traditionalChineseherbalmedicines 编号药材名大肠埃希菌铜绿假单胞菌白色念珠菌标准菌(n=1)耐药菌(n=3)标准菌(n= 1)耐药菌(n=2)耐药菌(n=4)抑菌圈(mm)MIC(mg/ml)MIC(mg/ml)抑菌圈(mm)MIC(mg/ml)MIC(mg/ml)抑菌圈(mm)MIC(mg/ml)1石榴皮1925.08.3176.23.6172.3虎杖 ------178.62赤芍166.21.3160.81.1241.83黄柏15 -------4重楼 ------1613.35地榆 ---133.1 -165.56苏木1425.0 -126.2 ---7黄芩121.6 -116.2 ---8生大黄1212.5 -1112.5 ---9半枝莲1212.5 -1312.5 ---10大活血1012.5 -1250.0 ---11黄连10 ----254.7注 :表中数据为3次平行试验的平均值 ;“ -”表示抑菌圈<10mmnotes:thedatainthetablewerethemeanvalueof3paralleltests;“ -”representtheinhibitionzone<10mm2 2乙醇提取物的制备将47种中草药粉碎成粗粉 ,各称取粉末30g,用80 %的乙醇150ml浸泡3次 ,第1次浸泡1wk ,第2、3次浸泡3d～4d ,过滤 ,合并滤液 ,用旋转蒸发仪减压至40℃以下 ,回收溶剂 ,用结晶刀转移至空安瓿瓶中备用。2 3药液的制备用电子分析天平称取提取物各100mg,以无菌蒸馏水 (含5 %二甲基亚砜助溶剂 )配成浓度为100mg/ml的溶液作初筛用。取上述溶液 ,采用2倍稀释法 <1>,即取10支无菌试管 ,每支无菌试管加入0 5ml蒸馏水 ,编号 ,取0 5ml原药液置于第1支试管中 ,均匀混合 ,继而吸取0 5ml加入第2支试管内 ,依次类推稀释至第9管 ,弃去0 5ml,第10管作为对照管 ,所得不同浓度的药液可用于测定最低抑菌浓度 (MIC)。2 4菌液的制备<1>将菌株接种于普通琼脂平板上 ,置于35℃恒温箱中培养24h ,用接种环将菌株转移至试管中 ,加入无菌生理盐水 ,配成浓度为1 5亿个/ml的菌液作初筛用 ,再稀释成浓度为106 个/ml的菌液用于测定MIC。2 5抑菌试验测定方法为琼脂扩散法 <1 ,5>。初筛 :用无菌棉签将浓度为1 5亿个/ml的标准菌液均匀涂布于M -H氏琼脂培养基上 ,然后用直径为6mm的无菌圆形玻璃管打孔 ,将含有各提取物浓度为100mg/ml的药液加入孔中 ,加满为止 ,不得溢出。再将培养皿置于35℃恒温箱中培养24h(抗白色念珠菌试验用沙氏琼脂培养基 ,于28℃下培养48h) ,取出观察 ,用卡尺测量抑菌圈的直径。MIC的测定 :方法同初筛 ,选择对标准菌的抑菌圈直径≥10mm的提取物 ,分别将不同浓度的药液加入孔中进行带菌培养 ,抑菌圈直径≥10mm的最低药液浓度即为其MIC值。再将赤芍和石榴皮的乙醇提取物以同法测定耐药菌的MIC值 ,结果详见表2。3讨论由表1可见 ,2种临床分离菌株对常用抗生素具有不同程度的耐药性。47种中草药提取物用标准菌初筛后发现 ,有11种中草药的抑菌圈≥10mm(如表2所示 ) ,并呈现不同强度的抑制活性。赤芍提取物对3种病原菌大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌特别是耐药菌的抑制活性均较高 ,其在抑菌圈≥10mm时的MIC分别是1 3、1 1、0 8mg/ml;石榴皮对3种菌的MIC也较高 ,分别是8 3、3 6、2 3mg/ml ,呈现广谱抗菌特性。各提取物的抑菌圈大小顺序依次是 :石榴皮>赤芍>黄柏>苏木>黄芩=生大黄=半枝莲>大活血>黄连 (大肠埃希菌 ) ;石榴皮>赤芍>地榆=半枝莲>苏木=大活血>黄芩=生大黄 (铜绿假单胞菌 ) ;黄连>赤芍>石榴皮=虎杖>重楼=地榆 (白色念珠菌 )。本研究结果表明 ,中草药提取物的抑菌圈大小与其相应的MIC值不一定成平行关系 ,这可能是由于中草药提取物含有多种成分而各成分的活性强度各不相同所致。因此 ,还需要进一步跟踪、研究提取物中各成分的抑菌活性大小。白色念珠菌为天然耐药菌 ,对大量长期应用抗生素和久治不愈的重症感染患者具有很大的威胁 ,而赤芍和石榴皮对该菌株表现出强抑制活性 ,值得重视。至于这些中草药提取物在体内的抗菌活性如何 ,尚需进一步研究47种中草药提取物的体外抗菌活性筛选研究@左国营$成都军区昆明总医院药剂科!昆明市650032
@韩峻$云南中医学院!昆明市650031
@余巍$成都军区昆明总医院药剂科!昆明市650032
@徐贵丽$成都军区昆明总医院药剂科!昆明市650032
@王根春$成都军区昆明总医院药剂科!昆明市650032中草药;;
醇提物;;
抗菌活性;;最低抑菌浓度目的:测定47种中草药的80 %乙醇提取物的体外抗菌活性。方法:对大肠埃希菌、铜绿假单胞菌进行抗生素药敏试验;制备47 种中草药醇提物,采用常规琼脂扩散法进行体外抑菌试验。结果:47种中草药的醇提物中有11 种对大肠埃希菌、铜绿假单胞菌和白色念珠菌有不同程度的抑制活性;其中尤以赤芍和石榴皮的醇 提物抗耐药菌活性最高,赤芍醇提物对上述3种菌特别是耐药菌的抑制活性均较高,其最低抑菌浓度(MIC)分别为13、1 1、1 8mg/ml;石榴皮醇提物对上述3种菌的抑制活性也较高,其MIC分别为8 3、3 6、2 3mg/ml。结论:赤芍和石榴皮醇提物呈现广谱抗菌特性,且具有抗耐药菌作用。<1>钟有添 ,马廉兰中草药和常用抗生素对绿脓杆菌的抑菌实验
赣南医学院学报,2001,21(3):244
<2>马廉兰,张文平,曾祥凤,等116种中草药对白念珠菌的抑菌实验赣南医学院学报,1998,18(3):189
<3>雷连成,韩文瑜,乔红伟大肠埃希菌耐药性中药抑制剂的初步研究吉林农业大学学报,2003,25(4):429
<4>王嵩中草药抗细菌感染的研究北京中医杂志,2002,21(4):249
<5>廖庆文,刘绍贵,田育望玄麦咽康含片的解热与体内外抑菌实验研究中国药房,2002,13(2):74药的抑菌圈≥10mm(如表2所示 ) ,并呈现不同强度的抑制活性。赤芍提取物对3种病原菌大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌特别是耐药菌的抑制活性均较高 ,其在抑菌圈≥10mm时的MIC分别是1 3、1 1、0 8mg/ml;石榴皮对3种菌的MIC也较高 ,分别是8 3、3 6、2 3mg/ml ,呈现广谱抗菌特性。各提取物的抑菌圈大小顺序依次是 :石榴皮>赤芍>黄柏>苏木>黄芩=生大黄=半枝莲>大活血>黄连 (大肠埃希菌 ) ;石榴皮>赤芍>地榆=半枝莲>苏木=大活血>黄芩=生大黄 (铜绿假单胞菌 ) ;黄连>
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