细辛为常用的解表药,来源于马兜铃科细辛属植物北细辛Asarumheterotropoid esFr.Schmidtvar.mandshuricum(Maxim.)Kitag.、华细辛A.sieboldiiMiq.和汉城细辛A.sieboldiiMiq.f.seoulense(Nakai)C. Y.ChengetC.S.Yang的全草,Kelly<1>曾利用形态学特征和ITS序列 特征对细辛属系统演化进行了研究,其中中国有分布的8种细辛属植物的ITS序列在EMBL中 已经注册,但对细辛药材的主流品种北细辛、汉城细辛未进行研究,而且北细辛和汉城细辛的归属 一直存在争议<2>,由于细辛属多种植物在不同地区均作细辛使用,用其他方法难以鉴别,因此 作者对细辛药材3个来源进行了ITS序列测定,并结合EMBL收载的我国产其他细辛属植物的 ITS序列进行分析,试图阐明细辛药材3个基源同等入药的遗传基础、汉城细辛和北细辛的分类 位置及细辛分子鉴别的可能性。1材料和方法1.1材料北细辛、汉城细辛采于辽宁本溪,华细辛 采于安徽黄山,均由北京中医药大学杨春澍教授鉴定。EMBL中收载的、本研究引用的其他细辛 属植物如下:杜衡A.forbesii(EMBL编号AF061481,AF061482) 、短尾细辛A.caudigerellum(EMBL编号AF061465,AF06146 6)、铜钱细辛A.debile(EMBL编号AF061467,AF061468)、双叶 细辛A.caulescens(EMBL编号AF061457,AF061458)、尾花细 辛A.caudigerum(EMBL编号AF061463,AF061464)、单叶细辛 A.himalaicum(EMBL编号AF061461,AF061462)、长毛细辛A.pulchellum(EMBL编号AF061469,AF061470);马蹄香属马蹄香Sarumahenryi(EMBL编号AF061552,AF061553)。1.2总DNA的提取采取CTAB法<3>1.3ITS片断扩增与纯化采取ITS15.8S ITS2整段扩增,引物序列如下:P1:5′GGAAGTAAAAGT CGTAACAAGG3′;P2:5′TCCTCCTCCGCTTA TTGATATGC3′;扩增反应在PE公司的9600型PCR仪上进行,反应体积50μL, 包括10×PCRBuffer(0.05mol·L-1KCl,0.1mol·L-1Tri s.HCl,pH9.0,1.0%TritonX100)5μL;MgCl2(0.025m ol·L-1)3μL;0.3μL的TaqDNA聚合酶;dNTP(0.01mol·L-1 )1μL;P1(0.025mol·L-1)和P4(0.025mol·L-1)各0.4μ L;BSA5μL(25mg·mL-1);模板5μL(10ng左右总DNA),超纯水补至 50μL。扩增条件为94℃预变性6min;72℃整理1min;94℃变性1min;57 ℃退火1.4ITS序列的测定测序仪器为ABI377,测序方法为双脱氧终止法,测序条件: 95℃20s,50℃20s,60℃1min。30个循环。1.5排序和分析ITS的范围根 据已发表的细辛属植物ITS确定,利用CLUSTALX软件进行序列排序,由于5.8S序列 相同,排序中未予考虑,排序后的序列使用MEGA2分子进化遗传分析软件,Kimura2参 数遗传距离,采用邻接法(NJ)、最小进化法(ME)、俭约法(MP)构建系统树,系统树各 分支的置信度用自举检验法(bootstraptest)检验,共进行2000次循环,以评价各分支的系统学意义和可靠性。2结果2.1本研究共测得细辛药材3个来源的ITS15.8SITS2完整序列,其中华细辛在EMBL中已注册,笔者测得的数据和其相同,三者ITS1的长 度范围为253～254bp,与其他细辛属植物(254～256bp)差异不大,GC含量( 51.4%～52.4%)和杜衡(53.0%)相近,和其他细辛属植物(46.8%～48. 0%)有比较大的差异;ITS2的长度均为221bp,和杜衡相同,但和其他细辛属植物(2 27bp)相比,有6个碱基的缺失,GC含量51.1%～52.9%,和杜衡(55.2%) 、短尾细辛(50.2%)相近,和其他细辛属植物(49.3%～49.8%)差异较大(见表 1)。2.2排列后的ITS序列见图1,根据Kimμra2参数遗传距离模型计算得到的序列 间遗传距离(×100)(见表2),细辛属植物的平均种间遗传距离为4.15,种间遗传距离 范围为1.07～9.19,北细辛和华细辛、汉城细辛和华细辛、北细辛和汉城细辛之间的遗传 距离分别是1.50,1.94和1.29。表1细辛药材3个来源和其他细辛属植物的ITS1和ITS2长度及GC含量编号ITS1长度/bpGC含量/%ITS2长度/bpGC含量/%总长度/bpMh25551.422152.9476Sd25452.422152.5475So2555 1.422151.1476Cr25646.822749.3483Pl25448.022 749.4481Cc25447.622749.8481Db25448.422749.4 481Cl25547.022750.2482Fb25553.022155.2476Hc 25448.022749.3481注:Mh.
北细辛;Sd.华细辛;So.汉城细辛;Cr .尾花细辛;Pl.长毛细辛;Cc.双叶细辛;Db.铜钱细辛;Cl.短尾细辛;Fb.杜衡 ;Hc.单叶细辛(表2,图1,2同)2.3由于马蹄香属与细辛属相近,选择马蹄香为外类群 ,根据ITS序列重建邻接树(NJ)、最小进化树(ME)和俭约树(MP),三者构建的系统 发育树相似,仅展示邻接树(见图2),3个系统发育树均显示细辛药材3个来源均形成一个高度 稳定的分支,支持率为99%～100%,其中北细辛和汉城细辛先形成1个分支,再和华细辛形 成1个分支。3讨论3.1细辛药材基源亲缘关系探讨本研究显示细辛药材3个来源在拓扑树上形 成稳定的分支,支持率达到100%,而且GC含量、ITS序列的长度也支持该分支为亲缘关系 很近的稳定类群,和其他细辛属植物具有明显的区别,进一步证实亲缘关系越相近,化学成分越相 似,临床上越有可能相互替代的规律,暗示分子系统学在中药新资源筛选中的巨大潜力。表2基于kimura2细辛属10种植物及外类群的ITS序列遗传距离MhSdSoFbClDbCcCrHcPlMh Sd1.50So1.291.94Fb9.198.708.21Cl6.726.255.78 7.24Db7.667.196.717.451.28Cc6.726.255.786.2 81.722.15Cr6.976.506.036.531.942.371.07Hc7. 206.736.256.752.162.591.281.50Pl7.196.726.2 46.741.722.591.281.501.72Sr11.8111.3110.801 2.6510.0610.289.569.329.569.823.2北细辛的分类位置探讨 北细辛的分类位置一直存在争论,有人认为北细辛是华细辛的变种A.sieboidiivar .mandshuricum,有人认为其是库页细辛的变种A.heterotropoide svar.mandshuricum,邻接·033·第30卷第5期2005年3月中国中药杂志ChinaJournalofChineseMateriaMedicaVol.30,Issue5March,2005图1细辛药材3个来源ITS1和ITS2序列 “·”表示与北细辛碱基相同,“-”表示碱基缺失图2邻接树树的拓扑结构显示,北细辛和华细 辛最先聚合,表示二者的亲缘关系最近,而且北细辛和华细辛之间的遗传距离为1.50,远低于 细辛属种间平均遗传距离(4.15),但是仍然在种的遗传距离范围之内(1.07～9.19 ),支持北细辛和华细辛是两个种,考虑到形态学特征,推断北细辛是库页细辛的变种。3.3汉 城细辛的分类位置探讨有人认为汉城细辛是华细辛的变种或变型A.sieboldiivar. seoulense,A.sieboldiif.seoulense,有人认为是库叶细辛的 变种Asiasarumheterotropoidesvar.seoulense,从拓扑 树结构来看,汉城细辛与华细辛和北细辛组成的分支再聚合,说明汉城细辛和北细辛、库页细辛都 有密切的关系,从遗传距离分析,汉城细辛和华细辛之间的遗传距离仅为1.94,和北细辛之间 的遗传距离为1.29,均低于细辛属种间平均遗传距离(4.15),而仍然在种的遗传距离范 围之内(1.07～9.19),汉城细辛和北细辛、华细辛之间均达到种间差异,支持汉城细辛 作为单独的种,由于汉城细辛和华细辛形态差异较小,因此对汉城细辛的分类位置还需结合其他证 据进一步研究。3.4细辛药材基源的分子鉴别ITS序列排序结果显示细辛药材3个基源ITS 序列的总长度为475～476bp,本文涉及的其他细辛属植物为481～483bp(仅杜衡 为476bp),正品细辛和非正品细辛有较大差异,其中北细辛和华细辛有8个碱基的差异,汉 城细辛和华细辛由10个碱基差异,北细辛和汉城细辛·133·第30卷第5期2005年3月中国中药杂志ChinaJournalofChineseMateriaMedicaVol.30,Issue5March,2005由6个碱基的差异,实验所引用的其他细辛属植 物的ITS序列与正品细辛均有差异,因此ITS序列可用于正品细辛和伪品细辛、细辛药材3个来源之间的药材鉴别。基于核DNAITS序列的细辛药材基源及
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