复方鱼腥草喷雾剂是广州军区广州总医院药剂科研制的制剂,由鱼腥草、
菊花、甘草经水煎煮,煎出 液浓缩后加乙醇,提取上清液分散于适量生理盐水中,搅拌均匀,即得,用于治疗病毒感染性疾病 。鱼腥草为三白草科植物蕺菜(HouttuyniacordataThunb)的地上部分, 既是一种传统药用植物,又是产自民间的特味野菜。其非挥发油提取物主要是以槲皮素为苷元的槲 皮苷(quercitrin),有较强的抗病毒作用<1,2>。国内外用组织培养观察到鱼腥 草提取物对亚洲甲型病毒有抑制作用,而朱氏等人观察经流感病毒(FM1)感染过的小鼠发现鱼 腥草的非挥发部分提取物对其有明显的保护作用<3>。鱼腥草是复方鱼腥草喷雾剂中抗病毒的主 要成分,因此选择对鱼腥草中的槲皮素进行含量测定。1试验材料1.1仪器Agilent11 00高效液相色谱仪,G1312A二元泵,G1313A自动进样器,G1315BDAD检测 器,A08.03工作站;CQ50超声波清洗器(上海超声波仪器厂);层析缸。1.2试剂甲 醇(色谱纯),磷酸、正丁醇、氨水、乙醇(AR),槲皮素对照品(中国药品生物制品检定所, 批号0081-9304),绿原酸对照品(中国药品生物制品检定所,批号:0753-960 7),甘草对照药材(批号:120904-200,中国药品生物制品检定所),复方鱼腥草喷 雾剂(广州军区广州总医院制剂室生产,批号:031201、031225、040116)。 2方法与结果2.1菊花的薄层鉴别取绿原酸对照品适量,加甲醇制成每毫升约含0.1mg的对 照品溶液。取复方鱼腥草喷雾剂10mL,置蒸发皿中在水浴上蒸干,残渣加甲醇溶解,滤过定容 至2mL,作为供试品溶液。取对照品溶液、供试品溶液各5μL,分别点于同一聚酰胺薄膜上, 以36%醋酸为展开剂,上行展开10cm,取出,晾干,置紫外灯(365nm)下检视。供试 品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同的蓝色斑点。见图1A。2.2甘草的薄层鉴别 取甘草对照药材1.0g,加甲醇15mL,超声处理15min,滤过,滤液作为对照品溶液; 与“2.1”项下同法制备供试品溶液。取对照品溶液、供试品溶液各5μL,分别点于同一硅胶 G板上,以ψ(正丁醇∶氨水∶乙醇)=5∶2∶1为展开剂,上行展开10cm,取出,晾干, 喷以ρ=10%硫酸乙醇溶液,在105℃加热5min,置紫外灯(365nm)下检视。供试 品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点。见图1B。2.3阴性对照用与 本品相同工艺制得以上两味药材的阴性对照品溶液,在同一薄层条件下鉴别,方中药材成分互相无 干扰。见图1。1.
对照品(或对照药材);2.供试品;3.阴性对照图1复方鱼腥草喷雾剂T LC鉴别图谱(A菊花B甘草)Fig.1TLCchromatogramofthecomp oundhouttuyniaspray2.4槲皮素含量测定2.4.1色谱条件与系统适应 性试验色谱柱:DiamondC18(5μm,4.6mm×220mm),
流动相:ψ(甲醇 ∶0.4%磷酸)=1∶1,流速:1.0mL/min,检测波长:370nm,柱温:室温, 进样量:10μL,理论板数按槲皮素峰计算应不低于4000。色谱图见图2。2.4.2测定 方法精密量取复方鱼腥草喷雾剂2.00mL,置水浴上蒸干,残渣用15mL甲醇溶解并转移至 圆底烧瓶内,加HCL1mL,置水浴中加热回A槲皮素对照品;B水解前;C水解后;D阴性对 照图2复方鱼腥草喷雾剂HPLC图谱Fig.2HPLCchromatogramsofth ecompoundhouttuyniaspray流30min,室温冷却后,超声处理5m in,再转移至20mL容量瓶中,用甲醇定容至刻度,作为供试品溶液。另精密称取105℃干 燥至恒重的槲皮素对照品适量,用适量甲醇溶解并制成约0.1mg/mL槲皮素的甲醇溶液,作 为对照品溶液。吸取上述对照品溶液及供试品溶液各10μL,注入色谱仪,按外标法计算供试品 中槲皮素的含量。2.4.3线性关系考察取“2.4.2”项下对照品溶液适量,加甲醇稀释制 成分别含槲皮素约为1、10、25、50、100、200μg/mL的对照品系列溶液。分别 取10μL,按上述色谱条件测定,以峰面积积分值为纵坐标,槲皮素质量浓度为横坐标,绘制标 准曲线,结果表明,在1～100μg/mL浓度范围内,呈良好的线性关系,回归方程A=38 85.25C-0.7079(r=0.9998,n=6)。最低检出浓度0.2μg/mL。 2.4.4精密度试验取上述的对照品溶液10μL,重复进样6次,槲皮素峰面积依次为383 5.7、3785.7、3796.6、3867.1、3794.6、3862.0,RSD= 0.94%(n=6)。2.4.5重复性试验取同一批号的样品5份,按“2.4.2”项下方 法操作,计算测定方法重复性,5次测定结果的RSD为1.78%(n=5)。2.4.6加样 回收率试验精密量取已知含量的样品2mL(73.46μg/mL),准确加入一定量的槲皮素 对照品,按“2.4.2”项下方法测定,结果见表1。表1加样回收率试验结果Tab.1Re sultofrecoverytest(n=6)m样品量/μgm加入量/μgm测得量/μ g回收率/%RSD/%73.46129.6195.696.373.46129.6193 .795.473.4664.8135.197.773.4664.8132.695.97 3.4632.4104.398.573.4632.4102.596.8平均96.81. 22.4.7稳定性考察取供试品溶液10μL,分别在1、2、4h测得槲皮素峰面积为278 .58、276.33、279.33,RSD%=0.42(n=3),可见样品4h内测定结 果保持稳定。2.4.8样品测定测定3批样品(批号:031201;031225;0401 16),计算槲皮素含量分别为:73.46,72.81,85.05μg/mL。3讨论3. 1测定波长的确定槲皮素对照品在200～600nm范围内扫描,结果在258nm,370n m处有最大吸收。但在258nm处槲皮素峰与其他组分峰未能达到基线分离,在370nm处可 达到基线分离,故选择以370nm处为检测波长。见图3。1槲皮素对照品;2样品图3紫外光 谱图Fig.3UVspectra3.2水解时间考察精密量取同一批号复方鱼腥草喷雾剂6份,分别考察不同水解时间槲皮素峰面积,结果30min及60min两者无显著性差异<4>,故选取30min作为水解时间。见表2。表2水解时间考察Tab.2HydrolysisTestt/min12330323.1325.8333.260330.4337.9335.43. 3流动相的组成对槲皮素的分离起着重要的作用。流动相分别选择了甲醇0.4%磷酸溶液体积比 分别为50∶50、70∶30、40∶60;乙腈0.4%磷酸溶液体积比分别为30∶70、 45∶55等进行考察,实验表明,当甲醇0.4%磷酸体积比50∶50时,明显改善了峰的拖 尾现象,使槲皮素与其他成分得到较好的分离。3.4有文献报道为了使槲皮素苷元类黄酮苷均水 解为苷元,选用ρ=5%硫酸乙醇加热回流水解,水解4h基本水解完全<5>。本文选用1mo l/L盐酸和甲醇水解30min,槲皮苷基本水解完全,方法更快速。复方鱼腥草喷雾剂质量标准研究@张强$广州军区广州总医院药学部!广东广州510010
@韩丽萍$广州军区广州总医院药学部!广东广州510010
@刘演波$广州军区广州总医院药学部!广东广州510010喷雾剂;;
反相高效液相色谱;;槲 皮素;;鱼腥草目的建立复方鱼腥草喷雾剂质量检测标准。方法采用TLC定性鉴别菊花、甘草; 采用HPLC法测定制剂中槲皮素含量:C18柱色谱柱,以ψ(甲醇∶0.4%磷酸)=1∶1 为流动相,流速1.0mL/min,测定波长为370nm。结果TLC鉴别菊花、甘草,斑点 清晰,易于判断;槲皮素在1～100μg/mL范围内呈良好线性,r=0.9998,平均回 收率96.8%(n=6),RSD=0.94%。结论本法具有良好的精密度和回收率,可作为 复方鱼腥草喷雾剂质量控制标准。<1>国家医药管理局中草药情报中心站编.植物药有效成分手册
.北京:人民卫生出版社,1986.877.
<2>朱宇同,杨汝才,苏章,等.鱼腥草非挥发油提取物抗病毒作用的初步研究.中草药,1983,14(7):25.
<3>李爽.鱼腥草的有效成分、药理作用及临床应用的研究进展.沈阳药科大学学报,1997,14(2):144.
<4>袁荫棠.概率论与数理统计(修订本).第2版.北京:中国人民大学出版社,1990.167-180.
<5>刘文尧,梁爱君,白皓.高效液相色谱法测定鱼腥草中槲皮素的含量.解放军药学学报 ,1999,15(6):40.锏交叻掷?故选择以370nm处为检测波长。见图3。1槲 皮素对照品;2样品图3紫外光谱图Fig.3UVspectra3.2水解时间考察精密量取 同一批号复方鱼腥草喷雾剂6份,分别考察不同水解时间槲皮素峰面积,结果30min及60m in两者无显著性差异<4>,故选取30min作为水解时间。见表2。表2水解时间考察Tab.2HydrolysisTestt/min12330323.1325.8333.260330.4337.9335.43. 3流动相的组成对槲皮素的分离起着重要的作用。流动相分别选择了甲醇0.4%磷酸溶液体积比 分别为50∶50、70∶30、40∶60;乙腈0.4%磷酸溶液体积比分别为30∶70、45∶55等进行考察,实验表明,当甲醇0.4%磷酸体积比50∶50时,明
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