扇贝多肽 (polypeptidesisolatedfromChlamysfarreri,PCF)是近年来本课题组采用现代生物学技术从栉孔扇贝中提取出的一种具有生物活性的小分子多肽,分子量为 80 0 - 10 0 0。初步研究表明该多肽具有延缓动物皮肤的衰老作用1。本实验探讨PCF对UVB辐射损伤小鼠皮肤有无保护作用及其与抗氧化剂的关系 ,以期为PCF的临床应用提供依据1 材料和方法1.1 材料1.1.1 实验动物和试剂 昆明种无毛小鼠 ,雄性 ,体重18- 2 0g ,北京医科大学提供。扇贝多肽由中国科学院黄海水产研究所提取纯化。谷胱甘肽 (GSH -Px)、总抗氧化力 (T -AOC)、超氧化物歧化酶 (SOD)、丙二醛(MDA)检测试剂盒 :购自南京建成生物工程研究所。1.1.2 仪器设备 (1)透射电镜 :JEM - 12 0 0X型 ,日本岛津公司 ;(2 )图像分析仪 :VIDAS - 2 1型 ,日本产 ;(3)紫外线辐照仪 :购自北京师范大学。紫外线UVB光源的波长范围为 2 90～ 32 0nM。1.2 实验方法1.2 .1 UVB氧化损伤小鼠模型的制备 昆明种无毛小鼠 4 0只 ,雄性 ,体重 18～ 2 0g ,动物于实验前适应环境 1周 ,室温控制在 18～ 2 5℃ ,动物自由进食、饮水。随机分为双蒸水未照射组和UVB辐射组 <双蒸水对照组、5 %PCF组、2 0 %PCF组、10 %VitC组 >5组 ,每组 8只。背部涂双蒸水及其药物 1h后 (每只 1ml) ,将动物置于特制鼠笼内 ,暴露背部皮肤 ,置UVB特殊光源下 ,每天照射皮肤 1h(辐照强度为 5 .15× 10 -2 J cm2 ) ,连续照射 30天 (总辐照强度为 15 .4 5J cm2 )。然后处死动物 ,取部分皮肤组织进行形态学观察 ;取另一部分皮肤匀浆、提取上清液 ,- 2 0℃保存待测。1.2 .2 形态学观察1.2 .2 .1 光镜结构观察 取各组无毛小鼠皮肤 ,10 %甲醛固定 ,常规石蜡切片 ,HE染色。在光学显微镜下(× 4 0 0 )用测微尺测定表皮厚度和真皮组织单位面积内成纤维细胞数目。各组每张切片分别计数 6个视野 ,求其平均值。1.2 .2 .2 超微结构观察 取各组无毛小鼠皮肤 ,5 %戊二醛固定 2 4h。乙醇脱水后 ,环氧树脂包埋 ,超薄切片染色 ,透射电镜下观察皮肤的超微结构。1.2 .3 皮肤组织抗氧化指标和MDA的检测1.2 .3.1 总蛋白的测定 按说明书的要求 ,在测定抗氧化酶和MDA之前 ,以双缩脲法先测定 10 %皮肤组织匀浆上清液的总蛋白含量。1.2 .3.2 总抗氧化能力 (T -AOC)的测定 按说明书的要求 ,将皮肤组织匀浆上清液分组与编号同上 ,依Fe2 + 菲啉氧化还原显色原理 ,72 2型分光光度计测定各管吸光度 ,利用公式计算出T -AOC的含量。1.2 .3.3 超氧化物歧化酶、谷胱甘肽、丙二醛 (SOD、GSH -Px、MDA)的测定 按说明书的要求经预实验在正式测定样本之前 ,先求出样本的最佳加样量 ;每组 6个样品。测定各管的OD值 ,依公式计算出SOD、GSH-Px的活性和MDA含量。1.2 .4 统计学处理 用SPSS统计软件对实验结果先进行方差齐性检验 ,若方差不齐 ,则进行F′检验 ;若方差齐 ,则进行F检验 ;F检验有统计意义 ,进一步用Q检验进行组间比较。2 结果2 .1 PCF对UVB所致无毛小鼠皮肤成纤维细胞数目的影响 光镜下计数皮肤组织单位面积内成纤维细胞数目 ,求出各组平均值。UVB对照组小鼠皮肤的成纤维细胞数目较未损伤组显著减少 (P <0 .0 1) ,皮肤厚度未见明显改变。与UVB对照组比较 ,PCF组和VitC组可显著提高小鼠皮肤成纤维细胞的数目 ,PCF并可增加表皮厚度 (P <0 .0 5 )。其中 ,2 0 %PCF和 10 %VitC组与UVB对照组比较 ,差异显著 (P <0 .0 1)。PCF组之间比较 ,无显著性差异 (P >0 .0 5 ) (表 1和图 1- 5 )。表 1 UVB辐射小鼠表皮厚度和成纤维细胞数目的变化 ( x±s,n =8)组别成纤维细胞 (个 )平均厚度 (μm)未照射组 31.30± 5 .0 2 14 .8± 0 .1UVB对照组 2 2 .73± 4 .80 13.1± 0 .5UVB +5 %PCF 2 9.31± 2 .2 7Δ☆ 17.2± 0 .4 Δ☆UVB +2 0 %PCF 33.91± 4 .4 9▲ 19.0± 0 .8▲☆UVB +10 %VitC 31.5 0± 5 .6 3Δ 14 .4± 0 .8 UVB对照组与未损伤组比较 : P <0 .0 5 ;给药组与UVB对照组比较 :ΔP <0 .0 5 ;2 0 %与 5 %PCF比较 :▲P <0 .0 5 ;PCF组与VitC组比较 :☆P <0 .0 5。2 .2 PCF对UVB所致无毛小鼠皮肤组织超微结构的影响 电镜下可见照射后表皮细胞损伤 ,胞质内空泡形成 ,真皮成纤维细胞内粗面内质网、高尔基复合体、等细胞器减少 ,有的可见细胞核固缩 ,并可见胞内大的液泡状结构形成 (图 6 - 7)。PCF组表皮结构正常 ,其细胞内的张力丝及细胞间桥完好。真皮成纤维细胞粗面内质网丰富 ,尤其 2 0 %较 5 %组增多更显著 (图 8,9)。VitC组表皮细胞结构未见异常 ,真皮内的成纤维细胞结构与 5 %PCF组的结构相似 (图 10 )。2 .3 PCF对UVB所致无毛小鼠皮肤组织抗氧化指标和MDA的影响 UVB对照组SOD和T -AOC指标较未损伤组显著性降低 (P <0 .0 1) ,而MDA含量较未损伤组升高 ;两组间GSH -Px的活性无显著性差异。与UVB对照组比较 ,PCF组和VitC组T -AOC和SOD的活性均有不同程度的升高 ;MDA的含量降低 (P <0 .0 5 ) ;而GSH -Px的活性无显著性改变。 2 0 %PCF组T -AOC的升高和MDA降低的程度均较 5 %PCF组和10 %VitC组显著 (P <0 .0 1) (表 2 )。3 讨论有学者在研究紫外线对皮肤的氧化损伤时 ,在透射电镜下可见早期是弹力纤维的微纤维成分增粗、紊乱或聚集成团块。严重损伤者其弹力纤维分解为微粒基质组成的电子致密物质 ,失去其弹性特征 ,真皮胶原退行性变最终成为无定形物质。微血管扩张并扭曲 ,图 1 未损伤小鼠皮肤光镜结构 (× 2 0 0 ) 图 2 UVB损伤小鼠皮肤成纤维细胞数量减少 (× 2 0 0 ) 图 3 2 0 %PCF+UVB组表皮明显增厚↑ (× 2 0 0 ) 图 4 5 %PCF +UVB组表皮可见增厚↑ (× 2 0 0 ) 图 5 10 %VitC +UVB损伤组小鼠皮肤厚度未见明显改变 (× 2 0 0 ) 图 6 UVB组表皮细胞内质网扩张呈空泡状↑ (×5 0k) 图 7 UVB组小鼠成纤维细胞内线粒体嵴断裂↑核膜扩张▲ (× 2 0k) 图 8 2 0 %PCF +UVB组表皮细胞线粒体↑清晰可辨 ;粗面内质网显著增多、腔变宽▲ (× 2 0k) 图 9 5 %PCF +UVB组成纤维细胞粒体嵴可见断裂↑ ;粗面内质网增多▲ (× 2 0k) 图 10 10 %VitC +UVB组小鼠表皮细胞线粒体▲清晰可辨 ,仅见少量空泡状结构↑ (×2 5k)表 2 PCF对UVB所致无毛小鼠皮肤组织抗氧化指标和MDA含量的影响 ( x±s,n =8)组别GSH -Px(U)SOD(nU ml)T -AOC(U mg)MDA(nmol ml)未照射组 2 5 .88± 0 .10 5 .97± 0 .2 90 .2 9± 0 .0 35 4 96 .2 6± 10 2 1.87UVB +辐射对照组 2 6 .13± 0 .0 85 .17± 0 .78 0 .2 1± 0 .0 2 13994 .5 3± 85 3.93 UVB +5 %PCF 2 6 .5 5± 0 .0 6 6 .5 8± 0 .18Δ 0 .38± 0 .0 3Δ☆ 885 9.4 1± 111.4 7Δ☆UVB +2 0 %PCF 2 7.16± 0 .0 86 .77± 0 .18Δ 0 .4 7± 0 .0 5 Δ▲☆ 74 81.2 5± 177.6 5 Δ▲☆UVB +10 %VitC 2 6 .6 7± 0 .0 86 .89± 0 .5 1Δ 0 .4 6± 0 .0 4 Δ 11794 .5 3± 192 .5 7Δ UVB对照组与未损伤组比较 : P <0 .0 5 ;给药组与UVB对照组比较 :ΔP <0 .0 5 ;2 0 %与 5 %PCF比较 :▲P <0 .0 5 ;PCF组与VitC组比较 :☆P <0 .0 5。血管壁开始增厚最后变薄 ,变稀疏2 。本研究发现 ,UVB辐射对照组小鼠皮肤的表皮厚度未见明显变化 ,但是单位面积内成纤维细胞的数量减少 ;没有见到UVB辐射小鼠局部皮肤组织的炎性细胞浸润。可能与其所选择的UV的辐射强度不同所致。但是电镜下可见UVB对照组小鼠的表皮细胞损伤 ,胞质内可见空泡形成 ,真皮的成纤维细胞粗面内质网、高尔基复合体、线粒体等细胞器减少 ,有的可见细胞核固缩 ,明显可见胞内大的液泡状结构形成。这与其他研究结果基本一致 ,这表明UVB辐射损伤的模型已建立。作者曾研究发现扇贝多肽具有抗衰老、抗氧化活性 ,在体外可以保护免疫细胞免
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