1994年Kawano等<1> 首次报告 ,3例慢性病毒性心肌炎 (ViralMyocarditis ,VMC)患者心肌组织活检发现有多处灶性心肌细胞凋亡 ,认为细胞凋亡可能参与了VMC的发生发展。以后多项研究表明心肌组织中存在心肌细胞凋亡 ,是VMC发病的重要机制之一。血管紧张素Ⅱ (AngⅡ )是一种重要的生物活性物质 ,对AngⅡ的研究以前主要集中在调节血管张力、血流动力学及促进细胞生长、增殖的作用方面。近年研究表明 ,AngⅡ通过其受体(ATR)对细胞凋亡有促进或抑制作用 ,在不同细胞有不同的表现。研究表明 ,AngⅡ可诱导乳鼠及成年大鼠心肌细胞的凋亡<2 ,3> ,而是否参与VMC心肌细胞凋亡尚未见报道。心肌康在临床上对VMC患者有确切疗效 ,本研究拟观察其对VMC心肌细胞凋亡和ATRmRNA表达的影响 ,探讨对VMC的作用机制。材料与方法1.实验病毒、动物及模型 嗜鼠心肌柯萨奇病毒B3(CVB3,Nancy株 ,上海中山医院病毒性心脏病重点实验室提供 )。取 3周龄 ,雄性Balb/c小鼠 340只 ,体重 9～ 12g (复旦大学医学院动物实验中心提供 ,动物合格证号 :0 1116 ) ,首次腹腔注射CVB3稀释液 (内含 10 0TCID50 病毒 ) 0 1ml/只 ,常规饲养 ,后每隔 15d腹腔接种同种浓度病毒液0 1ml/只 ,共 3次。 5 0d以上仍成活的小鼠为VMC慢性期模型 ,共 115只。随机分为模型对照组 38只 ,心肌康组 38只 ,氯沙坦组 39只 ,另设 2 0只腹腔接种不含病毒的Eagles液小鼠为正常对照组。 河南省高校杰出科研人才创新工程项目 ( 2 0 0 1KYCX0 0 8)通讯作者 :朱明军 ,河南省郑州市人民路 190号 2 .试剂 原位细胞凋亡检测试剂盒 ,美国Oncogene公司 ;RNAexReagentSyatem试剂盒、10 0bpDNAMarker、上样缓冲液 ,上海华舜生物有限公司 ;AccessRT PCRSystem试剂盒 ,美国Promega公司 ;琼脂糖 ,上海生工生物技术公司。3.引物 AT1R、AT2 R、β action引物 ,上海生工生物技术公司。引物序列 :AT1R上游 5′ AT ACGCCAAGGAATGATGACA 3′ ,下游 5′ GGGCGGCG GTAGGAAAGAGTA 3′ ,扩增产物片段为 334bp ;AT2 R上游 5′ GCCTTCTTGGGGGTAAACAG 3′ ,下游5′ ATGGGACAGGCAGAGAATGAC 3′ ,扩增产物片段为 30 2bp ;β action上游 5′ GTAACCCACACTGTGCCC ATCT 3′ ,下游 5′ ACAGAGTACGCGCTCAGGAG 3′ ,扩增产物片段为 5 42bp。4 .实验药物及给药方法
心肌康 :黄芪、西洋参、麦冬、五味子、丹参、苦参等组成 ,由河南省中医院制剂室制成水煎剂 ,每ml相当于生药 2g ;氯沙坦钾片 (科索亚 ) :(国药准字X2 0 0 0 0 371) ,5 0mg/片 ,杭州默沙东制药有限公司生产 ,用无菌双蒸水配制成浓度为 2mg/ml的混悬液。5 .实验动物取材 用药 30d后 ,无菌解剖取出心脏 ,滤纸吸干水分 ,称重后沿左室长轴剪为两部分。一部分立即投入液氮中 ,后转入 - 70℃冰箱保存 ;另一部分放入 10 %中性缓冲福尔马林液中固定 ,2 4h后行组织学处理。6 .TUNEL法检测心肌细胞凋亡 根据Onco gene公司试剂盒说明书进行操作。7.逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)检测心肌中AT1R、AT2 RmRNA的表达 采用异硫氰酸胍一步法提取心肌组织总RNA ,具体操作按RT PCR试剂盒说明书。8.统计分析 所测数值用 x±s表示 ,采用单因素方差分析。结果1 光镜下可见凋亡细胞核呈棕黄色染色 ,非凋亡细胞核呈绿色染色。正常对照组小鼠心肌组织中未见到凋亡细胞 ,模型对照组、心肌康组、氯沙坦组均可见凋亡的心肌细胞。模型对照组小鼠平均心肌细胞凋亡百分率为 (4 0 2± 2 4 3) % ,心肌康组为 (1 79± 1 14 ) % ,氯沙坦组为(1 80± 1 19) %。经统计分析 ,心肌康组与氯沙坦组较模型对照组心肌细胞凋亡百分率明显降低 (P<0 0 5 )。2 .根据引物设计 ,AT1RmRNA、AT2 RmRNA及β -action的扩增产物片段分别为 334bp、 30 2bp、5 42bp ,经 1 5 %琼脂糖电泳后 ,与Marker比较 ,PCR产物片段长度与预期结果一致。 4组小鼠心肌组织内均可检测到AT1RmRNA表达 ,半定量分析其含量即AT1RmRNA/ β actionmRNA的比值。经统计学处理 ,模型对照组与氯沙坦组AT1RmRNA表达含量较正常对照组显著升高 (P <0 0 5 ) ;心肌康组较模型对照组与氯沙坦组显著降低 (P <0 0 5 )。见表 1。3.各组小鼠心肌组织中均有AT2 RmRNA表达 ,计算AT2 RmRNA的表达量即AT2 RmRNA/ β ac tionmRNA的比值 ,经统计分析 ,AT2 RmRNA表达量在各组小鼠心肌组织中无显著差异 (P >0 0 5 )。见表 2。讨论细胞凋亡又称程序性细胞死亡 ,是一种受基因调控的主动性细胞死亡。一般说来 ,只有处于生长周期的细胞才会发生凋亡。近几年的研究表明属终极分化细胞的心肌细胞在某些病理状态下 (如高血压心肌肥厚、心力衰竭、心肌梗死 )也会发生凋亡。心肌康由黄芪、西洋参、麦冬、五味子、丹参、苦参等组成 ,具有益气养阴、活血通络、清热解毒的作用 ,临床应用于VMC取得了显著的效果。为探讨本方更深层次的机制 ,笔者进行了本研究。表 1 RT PCR检测AT1RmRNA表达 ( x±s)组别nAT1 RmRNA β actionmRNA AT1 R/β action正常对照组 2 0 41 3 7± 12 0 5 5 1 84± 16 2 80 77± 0 13模型对照组 3 864 2 6± 13 90 5 8 18± 15 0 2 1 12± 0 11 心肌康组 3 85 0 40± 14 45 △ 5 8 5 2± 11 47 0 85± 0 16△氯沙坦组 3 95 7 5 0± 2 2 41 5 2 11± 14 181 0 7± 0 2 5 注 :与正常对照组比较 , P <0 0 5 ;与模型对照组及氯沙坦组比较 ,ΔP <0 0 5。表 2 RT PCR检测AT2 RmRNA结果 ( x±s)组别n AT2 RmRNA β actionmRNA AT2 R/β actoin正常对照组 2 0 3 0 5 8± 11 14 40 99± 4 5 40 74± 0 2 3模型对照组 3 83 6 2 7± 8 92 45 93± 12 67 0 83± 0 2 2心肌康组 3 83 2 2 9± 10 3 941 63± 10 840 78± 0 18氯沙坦组 3 93 4 63± 9 844 2 2 9± 4 12 0 81± 0 19本实验用TUNEL法检测VMC小鼠心肌细胞凋亡 ,结果发现正常对照组未见凋亡心肌细胞 ,模型对照组心肌细胞凋亡显著增加 ,表明细胞凋亡参与了慢性VMC的发生发展过程 ,心肌康组和氯沙坦组较模型对照组心肌细胞凋亡明显减少。凋亡的心肌细胞多呈散在分布 ,非坏死区域也发现单个心肌细胞凋亡。说明心肌康和氯沙坦具有抑制心肌细胞凋亡的作用。诱导和调控细胞凋亡的因素很多 ,近年来的研究发现AngⅡ参与细胞凋亡的调节。AngⅡ通过与其受体结合发挥生理作用 ,AngⅡ受体主要有两型 ,即AT1R和AT2 R ,AngⅡ的作用大部分是通过AT1R介导的。研究表明AngⅡ具有诱导心肌细胞凋亡的作用<4 ,5> 。虽然AngⅡ可以诱导心肌细胞凋亡 ,但关于其作用机制却仍有争议。多项研究发现AngⅡ通过AT1R介导参与心肌细胞凋亡<6 ,7> ,也有人对人类充血性心衰心肌的研究发现AngⅡ诱导心肌细胞凋亡的作用是由AT2 R介导的<8> 。药物对心肌细胞凋亡影响的研究报道不多 ,本实验主要观察心肌康对慢性期VMC小鼠心肌细胞凋亡及AngⅡ受体的影响。结果显示 ,模型对照组AT1RmRNA表达明显高于正常对照组 (P <0 0 5 ) ,表明AT1R参与VMC的发病 ,AngⅡ诱导心肌细胞凋亡的作用可能是通过AT1R介导的。心肌康组AT1RmRNA表达较模型对照组明显降低 (P <0 0 5 ) ,表明心肌康具有下调AT1RmRNA表达的作用。氯沙坦组与模型对照组比较 ,AT1RmRNA表达无显著性差异 (P >0 0 5 ) ,即氯沙坦对AT1RmRNA的表达没有影响。因氯沙坦为AT1R阻断剂 ,推测其减少心肌细胞凋亡的作用与其阻断AT1R有关 ,而非在AT1RmRNA表达水平上起抑制作用。通过对AT2 RmRNA表达的检测 ,发现各组心肌组织中AT2 RmRNA的表达无显著性差异 (P >0 0 5 ) ,表明AT2 R在VMC的发病中无明显作用 ,AngⅡ导致慢性VMC心肌细胞凋亡的作用可能与AT2 R无关。AngⅡ诱导细胞凋亡的机制 :①升高细胞内Ca2 + 浓度<9> ,Ca2 + 在细胞凋亡中起重要作用 ,参与细胞凋亡的核酸内切酶是Ca2 + 依赖性的。②调控凋亡相关基因 ,激活
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