加味丹参饮从《时方歌括》丹参饮化裁而来 ,是临床防治冠心病心绞痛的有效方剂。前期实验研究显示 ,该药对家兔食饵性动脉粥样硬化及心肌缺血和缺血后再灌注损伤具有显著的防治作用<1> ;并存在早期心肌缺血预处理样作用。本文以心肌缺血再灌注损伤家兔为受试对象 ,从心肌细胞形态结构的变化来探讨该方的延迟保护作用。1 实验材料1.1 药物 加味丹参饮由丹参、檀香、赤芍、川芎、当归、红花、生地黄等中药组成。药材购自湖南中医学院杏林大药房,经鉴定后 ,各药按比例配合 ,水煎两次 ,药液经 10 0 0r/min离心 10min祛除杂质 ,以生理盐水调整药液浓度为每ml药液含生药 2 g。临用时根据给药量和给药容积调整给药浓度。1.2 主要试剂及仪器 氯化三苯四唑 ( 2 ,3,5 -Tripheny -2H -TetrazoliamChloride ,TTC) :分析纯 ,批号 :2 0 0 2 0 6 2 0 ,上海三浦化工公司生产 ;伊文氏蓝 (Evan’sBlue,EB) ,批号 :92 75 18,Fluka公司进口分装 ;电子显微镜 :H - 6 0 0型 ,日本日立公司生产 ;数字彩色显微图像分析系统 :包括UVI凝胶图像分析系统 ,OPTIMAS数字彩色显微图像分析软件等 ;动物呼吸机 :DH - 14 0型 ,浙江医科大学医学仪器实验厂生产 ;冷冻切片机 :5 30 - 2 7型 ,德国ErnstLeitzLtd .生产 ;全自动显微摄影仪 :PM - 8AD型 ,日本Olympus公司生产。1.3 动物 健康家兔 ,体重 2 .5～ 3.0kg ,雌雄兼用 ,由湖南中医学院实验动物中心提供 ,合格证号 :医动字第 2 0 - 0 0 3号。2 实验方法2 .1 动物及缺血再灌注模型建立<2 > 家兔以 2 5 %的乌拉坦( 3～ 4ml/kg)经耳缘静脉注射麻醉后 ,背位固定。联接多道生理记录仪 ,记录标准Ⅱ导联心电图。在剑突右下方开一小口 ,分离十二指肠 ,以备给药。气管切开 ,连接动物呼吸机(潮气量 2 1ml,频率 5 0次 /min)。沿胸骨左缘 3～ 4肋间打开胸腔 ,暴露心脏 ,剪开心包膜做简易心包吊床 ,用止血钳轻轻提起左心耳 ,于心耳下左冠状动脉前降支上 1/ 3处穿线 ,左线两端各穿 1个结扎环 ,拉紧结扎环以阻断冠脉血流。以心电图出现弓背样抬高为结扎成功。2 .2 分组及试验方法 健康家兔 32只 ,随机分为假手术组(SOG)、缺血再灌注组 (IRG)、药物预处理组 (DPG)和缺血预处理组 (IPG) ,每组 8只 ,雌雄不拘。SOG :第 1日开胸 ,冠脉穿线不结扎 ,十二指肠给予生理盐水 ,剂量为 5ml/kg ,1h后关胸 ;2 4h后再次打开胸腔 ,冠脉穿线不结扎。IRG :第 1日处理同SOG ;2 4h后再次打开胸腔 ,结扎冠脉 6 0min后恢复冠脉血流 12 0min。DPG :第 1日除十二指肠给予相同体积的加味丹参饮煎液 (剂量为每kg兔给予 5 .86g生药 ,相当于70kg成年人临床等效剂量 )外 ,其余处理同SOG ;2 4h后再次打开胸腔 ,处理同IRG。IPG :第 1日开胸后结扎冠脉 5min ,再灌注 10min ,共反复 4次后关胸 ;2 4h后再次打开胸腔 ,处理同I/R组。另外各试验全程组动物耳缘均静脉滴注 0 .9%生理盐水 ,以维持水、电解质平衡。2 .3 反应指标检测方法 ( 1)心肌梗死面积的测定 :采用EB/TTC双染色法。实验结束后 ,迅速剪取心脏 ,用 0 .9%的生理盐水 10ml,经主动脉逆行冲洗心脏 ,收紧结扎线。从主动脉根部用注射器匀速推注 1%伊文氏蓝 2ml。剪去心底组织、心耳及右心室。 - 80℃冰箱冻存。自心尖部向心底部将左心室切成厚约 2ml切片 ,放入 1%TTC磷酸缓冲盐溶液中恒温 ( 37℃ )孵育 2 0min ,冷生理盐水冲去游离染料 ,10 0ml/L甲醛固定 ,切片显示 3种颜色 ,砖红色为正常心肌 ,蓝色为梗死危险区心肌 ,灰白色为梗死心肌。数码相机摄取各切片上下两面图像 ,在计算机彩色图像分析系统计算各兔心肌梗死危险区面积和心肌梗死区面积 ,心肌梗死程度以梗死面积百分比表示。梗死面积百分比计算公式 :梗死面积百分比 ( % )=(梗死区面积 /危险区面积 )× 10 0。 ( 2 )心肌形态及细胞超微结构 :实验结束后剪取心脏 ,于心尖上 1cm处横向切取厚约 0 .2cm的心肌 2片 ,置于 4 %的多聚甲醛溶液中固定保存 ,做石蜡切片 ,HE染色 ,光镜下观察心肌形态变化。另于冠脉穿线处下 0 .5cm处剪取一小块左心室前壁 ,用双面刀片将其切成 5mm× 1mm× 1mm小块 ,2 .5 %戊二醛固定 2 4h ;再用2 %锇酸固定 1h ;以 5 0 %、70 %、90 %、10 0 %丙酮梯度脱水 ,每级 10min ;37℃环氧树脂浸泡 2 4h ;Epon812环氧树指混合液 6 0℃包埋 2 4h ;定位 ;厚约 70 0埃左右超薄切片 ,电子染色 ,在透射电镜下观察心肌细胞超微结构的变化。2 .4 统计学处理 计量资料用均数±标准差 (X±S)表示 ,在SPSS10 .0统计软件上以方差分析和t检验进行统计分析 ,计数资料用x2 检验。3 实验结果3.1 对心肌病理形态学及细胞超微结构的影响 左心室前壁甲醛固定 ,石蜡包埋 ,间断连续切片 ,HE染色 ,光学显微镜下观察。结果显示 ,假手术组心肌纤维染色均匀 ,横纹清晰心肌间质无炎性细胞浸润 ,未出现出血、坏死 ;而心肌缺血再灌注组家兔部分心肌纤维断裂 ,有灶性出血 ,心肌间质大量炎性细胞浸润 ;药物预处理组织和缺血预处理组家兔部分心肌纤维呈波浪状 ,肌浆分布不匀 ,心肌间质无出血 ,有数量不等炎性细胞浸润。透射电镜观察 ,结果显示 :假手术组为正常心肌纤维结构 ,可见胞核 ,线粒体正常 ,肌纤维排裂整齐 ;缺血再灌注组心肌细胞水肿、空泡样变 ,肌纤维受水肿空泡挤压或肌纤维萎缩 ,间质胶原纤维增生 ,脂褐素颗粒增加 ;药物预处理组心肌结构基本正常 ,仅少数线粒体有轻度水肿 ;缺血预处理组心肌细胞几乎正常 ,偶见线粒体轻度水肿。以上结果提示 ,药物预处理和缺血预处理后 2 4h ,对家兔缺血再灌注心肌细胞正常形态结构的维持有明显的作用。3.2 对心肌梗死面积的影响 每只家兔心脏作 5个连续切片 ,经EB/TTC双染色后 ,在数字彩色图像分析系统进行微分计算。结果显示 :DPC组和IPC组家兔心肌梗死危险区面积比I/R组明显减少 (P <0 .0 1、P <0 .0 5 ) ,且DPC组减少幅度明显大于IPC组 (P <0 .0 5 ) ;对心肌梗死面积 ,DPC组和IPC组均显著少于I/R(P <0 .0 1) ,但两预处理组间差异无显著性 (P >0 .0 5 ) ;对心肌梗死面积百分比而言 ,两预处理组比I/R组均有所下降 ,但统计学处理仅IPC组下降有显著性意义 (P <0 .0 1)。见表 1。表 1 对心肌梗死危险区面积、梗死面积和梗死面积百分比的影响 ( % ,X±S)组别n危险区面积梗死面积梗死面积百分比IRG 5 5 7.97± 19.5 12 7.39± 9.92 4 7.31± 9.0 3DPG 5 18.0 7± 7.92 △6 .4 4± 3.4 4 37.2 8± 14 .85IPG 5 33.5 2± 16 .90 9.4 8± 7.34 2 7.6 1± 10 .4 0 注 :与IRG组比较 , P <0 .0 5 , P <0 .0 1;与IPG组比较 ,△P <0 .0 5以上结果提示 ,药物预处理和缺血预处理对预防缺血再灌注损伤所致的心肌缺血和心肌缺血梗死均有非常显著的作用 ,其中药物预处理对缩少心肌缺血区域作用明显优于缺血预处理组 ,表明药物预处理可能对建立缺血心肌侧枝循环及抗心肌缺血损伤有良好的作用。4 讨 论一次或多次短暂缺血—再灌注 ,可使心肌能耐受随后较长时间的缺血 ,缩小心肌梗死范围。缺血预处理 (IPC)后心肌保护作用出现两个不连续的时相变化 ,即早期保护作用(earlyprotection ,EP)和延迟保护作用 (delayed protection ,DP)。 1992年Yamashita等<3 > 等首次报道了IPC后心肌DP现象。他们在开胸犬经过经典IPC后闭塞冠脉前降枝90min ,再灌 5h ,以心肌梗死范围 (梗死区占危险区的百分比 )作为心肌保护的终指标 ,观察到心肌保护作用在IPC后 0h的出现 ,12h消失 ,2 4h重现。不久该现象得到进一步证实<4～ 5> ,并称之为心肌保护的第二窗口。随后大量文献资料支持IPC后心肌梗死面积显著缩小这一DP现象<6～ 9> 。尽管DP不如EP强大 ,但根据上述实验报道 ,DP的出现是一致的 ,可重复的。犬IPC后EP梗塞范围从对照 39.0± 3.7%～ 4 2 .0± 7.2 %到 14 .4± 2 .0 %～ 12 .5± 4 .0 % ,降低 6 3%～70 % ;DP梗死范围从 36 .2± 4 .8%～ 35 .1± 4 .6 %到 18.8±6 .7%～ 18.8± 3.4 % ,降低了 4 6 %～ 4 8% <3～ 4> 。免IPC后2 4h降低心肌梗死范围的幅度为 4 5 % <5> 。随着对预处理保护机制的深入研究 ,人们常运用一些药物进行预处理的诱导或阻断。有在体或离体给药 ,也有整体或局部给药 ,最常用的是与预
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