以往研究显示 ,一定浓度的肿瘤坏死因子可引起血管内皮细胞形态和合成释放vWF的改变 ,对抗这种改变可能是脑泰方提取物治疗缺血性中风的重要机制<1 > 。为了深入探讨这种改变的实质 ,本文拟从细胞凋亡的角度加以研究 ,现将实验结果报告如下。1 材料与方法1 .1 材料1 .1 .1 药品 脑泰方提取物 (NTE) :脑泰方由川芎、地龙等药物组成 ,经水煎、醇提后制成浸膏 (由湖南中医学院药学院制剂教研室提供 )。将其溶液经0 .2 2 μm微孔滤膜加压过滤除菌后 ,分装冻存。1 .1 .2 试剂 RPMI 1 6 40培养基干粉 :Gibco产品 ;胎牛血清 :天津TBD公司 ;胰蛋白酶 :美国Amiesco公司产品 ,上海生物工程技术服务有限公司分装 ;重组人肿瘤坏死因子 (rhTNF α) :PEPROTECHEC公司产品 ,晶美公司提供 ;兔抗人Ⅷ因子相关抗原血清 :Sigma公司 ;DAB显色试剂盒 :华美公司 ;SABC(兔IgG)免疫细胞化学试剂盒 :Boster公司 ;溴乙锭和吖啶橙 :Sigma公司等。新鲜胎儿脐带 :由长沙市妇幼保健院产科提供。1 .2 方法将 2 4孔培养板中生长良好并已融合的人脐静脉内皮细胞随机分为 6组 :NTE高、中、低剂量组 (终浓度 1 0 0ng mL的rhTNF α分别加上生药终浓度 6mg mL、2mg mL和 0 .6 7mg mL的NTE)、NTE对照组(仅加生药终浓度 2mg mL的NTE)、rhTNF α组 (仅加终浓度 1 0 0ng mL的rhTNF α)及空白对照组 (仅加等量PBS) ,每组 1 0孔 ,每孔培养液 1mL ,加rhTNF α或药物 1 0 μL。换液后 ,置 37℃、5 %CO2 环境中孵育2 4h后进行观察和指标检测。1 .2 .1 细胞凋亡的荧光染色观察 参考Duke等方法进行吖啶橙 (AO) 溴乙锭 (EB)双重荧光染色<2 > 。制备细胞悬液 ,调整细胞密度为 1 0 6个 mL ,取细胞悬液 2 5 μL ,加 2 μLAO染液 (1 0 0 μg mL)及 2 μLEB染液 (1 0 0 μg mL) ,滴于载玻片 ,盖片封片后荧光显微镜直接观察。按以下方法进行分类 :活细胞核染色质着绿色并呈正常结构 ;早期凋亡细胞核染色质着绿色呈固缩状或圆珠状 ;非凋亡的死亡细胞核染色质着橘红色并呈正常结构 ;晚期凋亡细胞核染色质为橘红色并呈固缩状或圆珠状。1 .2 .2 凋亡细胞的半定量分析 染色后 2 0min内在荧光显微镜下计数 2 0 0个细胞 ,并计算凋亡细胞率 :R(% ) =(早期凋亡细胞 +晚期凋亡细胞 ) 2 0 0。1 .3 统计学方法采用 χ2 检验和相关分析方法 ,在SPSS1 0 .0统计软件上进行分析处理。2 结果2 .1 AO EB双重荧光染色观察结果空白对照组和NTE对照组细胞为正常结构的活细胞 ,染色质主要着亮绿色 ,荧光强度不一、呈结构样 (见附图 - 1、2 ) ;TNF组与NTE低剂量组细胞大多呈均匀的橙色 ,且染色质多被染为橘红色 ,以固缩状或圆珠状为主 (见附图 - 3、4 ) ;NTE高、中剂量组细胞多呈黄绿色或亮绿色 ,荧光强度不一、呈结构样 (见附图 - 5、6 )。2 .2 AO EB双重荧光染色半定量分析结果由表 1可见 ,rhTNF α组凋亡细胞数显著增多 ,与空白对照组比较 ,差异有非常显著性 (P <0 .0 1 ) ;而NTE高、中剂量组可明显抑制这种变化 (P <0 .0 5 ) ;NTE低剂量组对rhTNF α引起的细胞凋亡有一定的抑制作用 ,但无统计学意义 (P >0 .0 5 )。对rhTNF α组、NTE高、中、低剂量组进行相关分析 ,结果显示 ,HUEC凋亡率与药物剂量具有显著的相关性 (r =0 .91 3,P <0 .0 1 )。此外 ,本实验中各组均可见部分非凋亡死细胞 ,可能是细胞分离过程中所造成的死亡。3 讨论以往研究结果显示<1 > ,单独加入rhTNF α后 6h即可见HUEC的正常外观发生改变 ,周边的部分细胞可见纵轴拉长 ,横轴缩小 ,而 2 4h后观察发现 ,多数细胞收缩变圆 ,或呈皱缩外观 ,甚至发生脱落 ,胞1 .空白对照组 ; 2 .NTE对照组 ; 3 .rhTNF α组 ; 4.NTE低剂量组 ; 5 .NTE中剂量组 ; 6.NTE高剂量组附图 人脐静脉内皮细胞吖啶橙 (AO) 溴乙锭 (EB)双重荧光染色图 (× 2 5 0 )表 1 AO EB染色后荧光显微镜下各期细胞计数结果 (个 )组 别细胞总数正常活细胞早期凋亡细胞晚期凋亡细胞非凋亡死细胞凋亡细胞率 ( %)空白对照组 2 0 0 162 7 2 110 14 .0NTE对照组 2 0 0 15 8111813 14 .5rhTNF α组 2 0 0 3 14 810 2 1975 .0 NTE低剂量组 2 0 0 4812 115 15 63 .5NTE中剂量组 2 0 0 763 472 185 3 .0 #NTE高剂量组 2 0 0 983 15 62 5 43 .5 # 注 :与空白对照组比较 P <0 .0 1;与TNF组比较 #P <0 .0 5。内显得粗糙有异常颗粒 ,提示HUEC可能出现过度凋亡。吖啶橙和溴乙锭 (AO EB)双重染色能区别开正常细胞、坏死细胞和凋亡细胞 ,是一种较常用的半定量的凋亡检测方法<3 > 。AO和EB均为荧光DNA染料 ,AO能透过胞膜完整的细胞 ,嵌入细胞核DNA ,使活细胞发出明亮的绿色荧光 ;当细胞死亡后 ,由于核内的DNA解聚 ,核的绿色荧光变红 ,这种现象称为细胞的“红—绿效应”<4> 。EB仅能透过胞膜受损的细胞 ,嵌入核DNA ,发橘红色荧光。凋亡的细胞呈现为染色增强 ,均匀一致的圆状或固缩状、团块状结构 ;非凋亡细胞核呈现荧光深浅不一的结构样特征。本实验结果显示 ,加入rhTNF α可使内皮细胞凋亡数目明显增多 ;而同时加入一定浓度的NTE ,可使HUEC发生凋亡的数目减少 ,作用优于TNF组 ,并且存在明显的量—效关系 ,提示NTE对rhTNF α诱导的HUEC凋亡具有明显的对抗作用脑泰方提取物抗肿瘤坏死因子诱导人脐静脉内皮细胞凋亡的研究@陈颂$湖南中医学院1999级硕士研究生班!湖南长沙410007
@葛金文$湖南中医学院血管生物学实验室!湖南长沙410007脑泰方提取物;;肿瘤坏死因子;;内皮细胞;;凋亡目的观察重组人肿瘤坏死因子α(rhTNF α)诱导人脐静脉内皮细胞(HUEC)凋亡及中药脑泰方提取物(NTE)的作用。方法将融合生长的HUEC随机分为空白对照组(正常培养,不加rhTNF α)、NTE对照组(加中剂量NTE ,不加rhTNF α)、rhTNF α组(仅加1 0 0ng mLrhTNF α)和NTE高、中、低剂量组(加1 0 0ng mLrhTNF α和6mg mL、2mg mL、0 .67mg mLNTE) ,观察rhTNF α作用2 4h后内皮细胞吖啶橙溴乙啶双重荧光染色和凋亡细胞计数。结果荧光显微镜下可见,空白对照组和NTE对照组HUEC为正常结构的活细胞、染色质主要着亮绿色,凋亡细胞率分别为1 4 .0 %和1 4 .5 %;rhTNF α组与NTE低剂量组细胞大多呈均匀橙色,染色质多被染为橘红色,以固缩状或圆珠状为主,凋亡细胞率分别为75 .0 %和63 .5 %;NTE高、中剂量组细胞多呈亮绿色,凋亡细胞率分别为43 .5 %和5 3 .0 %。结论一定浓度的肿瘤坏死因子引起的内皮细胞损伤主要表现为细胞凋亡,脑泰方提取物可明显抑 制这种凋亡的过度发生<1> 陈 颂,葛金文,邓冰湘.脑泰方提取物抗肿瘤坏死因子α诱导人脐静脉内皮细胞损伤的研究
.湖南中医学院学报,2002,22(4):7.
<2> DukeRC ,CohenJJ.Morphologicalandbiologicalassaysofapoptosis.CurrProtImmunol1992,(1):317.
<3> 袁小鹏,焦伟华,徐如祥.肿瘤细胞AO EB荧光染色法在药敏试验中的可行性探讨.癌症,1999,18(3):359.
<4> 许 屏.荧光和免疫荧光染色技术及应用.第2版.北京:人民卫生出版社,2000.5.湖南省中青年科技基金资助项目 ( 0 0JZY2 14 5 ) ;;
湖南省自然科学基金资助项目 ( 98JJY2 0 2 7)HUEC发生凋亡的数目减少 ,作用优于TNF组 ,并且存在明显的量—效关系 ,提示NTE对rhTNF α诱导的HUEC凋亡具有明显的对抗作用脑泰方提取物抗肿瘤坏死因子诱导人脐静脉内皮细胞凋亡的研究@陈颂$湖南中医学院1999级硕士研究生班!湖南长沙410007
@葛金文$湖南中医学院血管生物学实验室!湖南长沙410007脑泰方提取物;;肿瘤坏死因子;;内皮细胞;;凋亡目的观察重组人肿瘤坏死因子α(rhTNF α)诱导人脐静脉内皮细胞(HUEC)凋亡及中药脑泰方提取物(NTE)的作用。方法将融合生长的HUEC随机分为空白对照组(正常培养,不加rhTNF α)、NTE对照组(加中剂量NTE ,不加rhTNF α)、rhTNF α组(仅加1 0 0ng mLrhTNF α)和NTE高、中、低剂量组(加1 0 0ng mLrhTNF α和6mg mL、2mg mL、0 .67mg mLNTE) ,观察rhTNF
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