耐药结核病、特别是耐多药结核病 (MDR—BTB)的发生对结核病控制构成严重威胁 ,是该病死亡的主要原因之一。尽管新的抗结核化学药物不断问世 ,但由于新的耐药的产生不可避免 ,抗结核治疗面临着巨大的挑战。中医药抗结核的作用引起人们的关注和重视。月华丸是清代名医程钟龄所制 ,为中医治肺痨的传统名方。我们将月华丸改革剂型为胶囊 ,观察其体外对耐多药结核分枝杆菌活性的影响 ,以了解其体外药效的情况。现将实验方法及结果报告如下。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 培养基 改良罗氏培养基。1.1.2 药物 月华胶囊 ,0 .5g /粒 ,含生药 2 .5g/粒 ,由湖南中医学院第一附属医院制剂室提供。1.1.3 耐多药结核菌 耐多药结核分枝杆菌含义 ,即是指患者排出的结核分枝杆菌至少已对异烟肼和利福平产生耐药的结核分枝杆菌。从临床肺结核病患者痰液中分离出结核分枝杆菌菌株 ,经湖南省结核病防治所做菌型鉴定为人型 ,编号 4 78。耐药性测定 :采用绝对浓度法<1> 测定 ,每种药分别测定 2个不同的剂量。测定结果见表 1。表 1 临床分离人型结核分枝杆菌耐多药鉴定药 物 剂量 (μg/mL) 菌株生长异烟肼 (INH) 110+ + ++ + +对氨基水杨酸 (PAS) 110+ ++链霉素 (SM) 2 02 0 0+ ++乙胺丁醇 (EMB) 52 0+-利福平 (RFP) 5 02 5 0+ + ++利福喷丁 (RFT) 5 02 5 0++1.2 方法1.2 .1 不同浓度耐多药结核分枝杆菌菌液制备 试管几何级稀释法 :挑取在改良罗氏培养基上传代两周后生长良好的耐多药结核菌株菌落 2 0mg(湿重 )加入玻璃珠管中 ,轻轻摇动 3min ,使试管壁呈毛玻璃状 ,加 0 .5 %吐温 —80 0 .5mL再摇动 1min ,加入灭菌生理盐水 ,与预先制备好的细菌浓度标准比浊管比浊 ,制成 1mg/mL的菌湿重量菌悬液 ,再加生理盐水分别配制成实验所需要的几种不同菌量浓度的菌液 ,分别是 :10 - 1mg/mL ,10 - 2 mg/mL ,10 - 3 mg /mL ,10 - 4mg/mL ,放于 - 2 0℃的冰箱中保存待用。1.2 .2 含月华胶囊溶液培养基的制备 试管 2倍稀释法 :取适量月华胶囊去外壳取内容物 ,加灭菌蒸馏水于 6 0℃加热溶解 ,配成 1g/mL备用。将月华胶囊溶液 (1g/mL)再用灭菌蒸馏水进行稀释 ,使药物在培养基中为所设计的各种浓度 ,分别配制成含月华胶囊溶液为 5 0 0mg /mL ,2 5 0mg /mL ,12 5mg /mL ,6 2 .5mg/mL ,31.2 5mg/mL的含药培养基 ,将试管斜置血清凝固器内 90℃ 1h凝固灭菌 ,贮存于 4℃冰箱内待用。1.2 .3 细菌接种 (1)按文献报道<2 > 分别以灭菌吸管准确的吸取浓度为 10 - 2 mg/mL的菌液 0 .1mL种入含有 5种不同浓度月华胶囊溶液的含药培养基斜面上 ,同时接种 0 .1mL于不含药物的培养基斜面上 ,作为空白对照。重复 2次。 (2 )待前述结果出来后 ,又重新配制耐多药结核分枝杆菌对月华胶囊溶液敏感浓度的培养基共 12管 ,分别以灭菌吸管准确的吸取浓度为 10 - 1mg/mL ,10 - 2 mg /mL ,10 - 3 mg /mL ,10 - 4mg/mL不同菌量浓度的菌液 0 .1mL接种耐多药结核分枝杆菌对月华胶囊溶液敏感浓度的培养基斜面上 ,每相同菌液浓度分别观察 3个试管 ,同时设不含药物的做空白对照。 (3)上述所有的培养基均置于35℃培养箱中孵育 ,每周观察 1次 ,4周后报告结果。2 结果2 .1 判断标准1个月后 ,培养基上无菌落生长 ,为无耐多药结核杆菌生长 (高度敏感 ) ,表示 (- - ) ;菌落数少于2 0个为 (耐药 )表示 (+) ;菌落数≥ 2 0个为 (完全耐药 ) ,表示 (++) ,菌落数 2 0 0个以上表示 (+++)。2 .2 不同浓度药物对一定量菌液生长的影响 ,即最低抑菌浓度 (MIC)在多个不同浓度的含月华胶囊溶液培养基上 ,观察到月华胶囊溶液在试管内对 10 - 2 mg/mL菌量浓度耐多药结核分枝杆菌活性的影响 ,随其浓度的高低而有不同见表 2。重复 2次 ,结果不变。结果表明 :2 5 0mg/mL药液培养基中无结核菌落生长 ,得出耐多药结核分枝杆菌对月华胶囊溶液的敏感浓度为 2 5 0mg/mL ,即最低抑菌浓度 (MIC)。令人惊奇的是 5 0 0mg/mL药液培养基中有结核菌落生长 ,表明当月华胶囊溶液浓度达到一定值时 ,细菌对药物的敏感度不因药物浓度的增高而增高。2 .3 同一浓度药液对不同结核菌量的抑制作用根据上述耐多药结核分枝杆菌对月华胶囊溶液的敏感浓度情况 ,又另行观察到当月华胶囊溶液浓度在 2 5 0mg/mL时 ,耐药结核分枝杆菌对月华胶囊溶液敏感的最高菌量浓度为 10 - 2 mg/mL。结果见表 3。表 2 不同浓度月华胶囊溶液对耐多药结核菌的作用组 别 药物浓度(mg/mL)菌落数(个 ) 细菌对药物的敏感度月华胶囊溶液 5 0 0 .0 0 <2 0 +2 5 0 .0 0无菌落生长 -12 5 .0 0≥ 2 0 + +6 2 .5 0≥ 2 0 0 + +31.2 5 >2 0 0 + + +空白对照组 >2 0 0 + + + 注 :菌量 10 - 2 mg/mL重复 2次结果不变。 表 3 2 5 0mg/mL月华胶囊溶液对不同浓度耐多药结核菌的作用组 别 接种浓度(mg/mL)菌落数(个 ) 细菌对药物的敏感度耐多药结核菌 10 - 1≥ 2 0 + +10 - 2无菌落生长 -10 - 3无菌落生长 -10 - 4无菌落生长 -空白对照 10 - 4 >2 0 0 + + + 注 :每相同菌量观察 3个试管。3 讨论随着耐多药结核病的出现及抗结核化疗药耐药产生的不可避免和毒副作用的存在 ,中医药治疗结核病重新引起人们的注意。月华丸由熟地、生地、麦门冬、百部、三七、贝母、阿胶、桑叶、白菊花等组成 ,具有滋阴降火、消痰祛瘀、止咳定喘、杀虫保肺之功 ,主治肺痨久嗽。程钟龄自称“此阴虚发咳之圣药”。本方体现了中医治痨“一则杀其虫以绝其根本 ,一则补其虚以复其真元”的原则 ,且与中医其他抗痨方剂比较 ,具有效用兼全 ,力量更大 ,为治痨的特效方<3 > 。我们将传统月华丸改革剂型为胶囊 ,并运用于临床治疗肺结核者 (文章另待发表 ) ,发现能提高疗效、缩短疗程、减少化疗药毒副作用的损害。特别是对复治性、难治性肺结核治疗的良好效果提示了很好的治疗前景 ,因复治性、难治性肺结核病患者往往因耐药的产生 ,或 /和化疗药毒副作用的损害 ,影响疗效 ,或 /和不能坚持完程治疗。这就提示人们关注此方是否能治耐多药肺结核病 ,因目前缺乏其对结核分枝杆菌 ,尤其是对耐多药结核分枝杆菌的体外抗菌的实验性研究 ,因而我们设计了耐多药结核菌对月华胶囊的敏感性实验 ,对于再指导临床治疗耐多药结核病具有重要的实际意义。本次实验对月华胶囊体外对耐多药结核分枝杆菌生长的影响做了初步的探讨 ,得知临床分离耐多药结核分枝杆菌在菌量浓度为 10 - 2 mg/mL时对月华胶囊溶液的敏感度为 2 5 0mg/mL(即药物的MIC) ;且 2 5 0mg/mL浓度的月华胶囊溶液抑菌菌液终浓度为 10 - 2 mg /mL。这一浓度比一般采用的绝对浓度法的接种菌量 10 - 3 mg/mL<4 > 要高 ,表明月华胶囊溶液在试管内对耐多药结核菌有较好的抑制作用。这一结果为月华丸临床治疗耐多药肺结核病提供了一定的药效学的实验依据。耐人深思的是在实验中 ,我们发现耐多药结核杆菌对月华胶囊溶液的敏感度并不因为药物浓度的不断增高而增加 ,含 5 0 0mg/mL月华胶囊溶液高浓度的培养基上反而有耐多药结核菌菌落生长 ,这与一般化疗药浓度越高抑或杀菌效果越好的报道是不相一致的 ,说明月华胶囊对耐多药结核杆菌的体外作用具有双向性。另研究已知 ,由中药有机配伍组成的方剂的抗菌作用比单味药更强 ,不易产生耐药性 ,其原因可能是方剂中各种有效成分从不同环节抑制细菌的代谢或生物合成 ,表现出药效学的累加或互补。因此 ,月华胶囊体外对耐多药结核杆菌抑制的量效关系、各有效成分的确定及其抑菌机理 ,值得进一步研究。此外耐多药结核菌临床分离株对月华胶囊的敏感性的普遍性和广泛性还需进一步 探讨。月华胶囊对耐多药结核分枝杆菌抑菌效力的体外研究@欧阳建军$湖南中医学院基础课部!湖南长沙410007
@伍参荣$湖南中医学院基础课部!湖南长沙410007
@白于乾$湖南中医学院!2001级研究生班,湖南长沙410007月华胶囊;;耐多药结核杆 菌;;体外抑菌试验目的探讨传统方剂月华丸剂改为月华胶囊体外对耐多药结核菌的作用。方法采 用试管稀释法:①将药物做连续2倍稀释,观察当菌液浓度不变时,不同浓度月华胶囊溶液对耐多 药结核菌的抑制作用;②将耐多药结核菌做几何级稀释,观察当药液浓度不变时,不同浓度的耐多药结核菌对月华胶囊溶液的敏感性。结果①月华胶囊溶液对耐多药结核菌的最低抑菌浓度(MIC)2 5 0mg/mL ;②耐多药结核分枝杆菌对月华胶囊溶液敏感的最高菌量浓度为1 0 -2 mg/mL。结论月华胶囊溶液在试管中对耐多药结核杆菌有一定的抑制作用。<1> 李影林.临床微生物学及检验
.北京:人民卫生出版社,1995.357-378.
<2> 陆 宇,朱
More abstracts about the 月华胶囊对耐多药结核分枝杆菌抑菌效力的体外研究