抗凝因子和纤维蛋白溶解系统可以通过抑制凝血因子活性或者水解纤维蛋白来控制凝血平衡,维持血 液粘度并且防止因凝血过度对机体造成危害.这两个系统功能障碍可以导致中风、心肌梗死以及外 周动脉阻塞性等严重危害人体健康的疾病.尽管有肝素、口服香豆素、链激酶和尿激酶等药物多年 应用的历史,但是这些药物自身存在的毒副作用一直是临床治疗中无法解决的问题.随着医药基础 研究的不断推进,人们对参与凝血过程的多种酶、活性因子以及相关受体的认识逐渐深入.近年来 ,开发研制疗效更好、毒副作用更低的抗凝血、溶栓和抗血小板药物的研究工作备受科研人员的关 注.迄今为止,除了血液中存在抗凝因子外,人们已经从多种生物组织、体液中提取到各种各样的 抗凝血蛋白和溶栓酶,如水蛭素、蚯蚓纤溶酶、蛇毒抗凝血纤溶酶等,其中部分已经开发成抗凝和 溶栓类药物.虽然自然界中抗凝物质药效良好并且毒副作用小,但是由于原料缺乏,大量开发势必 影响环境资源的保护,因此利用现代先进生物技术获得具有高效抗凝及溶栓作用、价格低廉的生物 大分子成药已经成为目前该领域研究热点.笔者概括说明了凝血、抗凝和纤溶系统相互间的关系, 着重阐述了抗凝因子的类型、分子结构和作用机理,并且展望了今后抗凝、溶栓药物研究开发的前 景.1 凝血、抗凝与纤维蛋白溶解1.1 凝血因子和凝血途径凝血因子是直接参与凝血的物质 ,迄今为止发现的凝血因子共有14种,包括纤维蛋白原(因子Ⅰ)、凝血酶原(因子Ⅱ)、组织 凝血激素(因子Ⅲ)、Ca2+(因子Ⅳ)、前加速素(因子Ⅴ)、前转变素(因子Ⅶ)、抗血友病因子(因子Ⅷ)、血浆凝血激酶(因子Ⅸ)、StuartPrower因子(因子Ⅹ)、血浆凝血激酶前质(因子Ⅺ)、接触因子(因子Ⅻ)、纤维蛋白稳定 因子(因子Ⅷ)、前激肽释放酶和高分子量激肽原.这些因子中除Ca2+外,其余均为蛋白质. 因子Ⅱ,Ⅶ,Ⅸ,Ⅹ,Ⅺ,Ⅻ和前激肽释放酶都是内切蛋白酶,在血液中以酶原形式存在,当外界 刺激因素产生时,这些无活性的酶原被激活,从而引起凝血.血液凝固的过程基本上是一系列蛋白 质有限水解的过程,它分为三个阶段:因子Ⅹ激活成Ⅹa;因子Ⅱ(凝血酶原)激活成Ⅱa(凝血 酶);因子Ⅰ(纤维蛋白原)转变成为Ⅰa(纤维蛋白).因子Ⅹ激活可以通过两种激活途径共同 完成:内源性和外源性激活途径.完全依靠血浆内的凝血因子逐步使因子Ⅹ激活从而发生凝血的途 径,称为内源性激活途径;而依靠血管外组织释放因子Ⅲ来参与因子Ⅹ激活的途径,称为外源性激 活途径.一般来说,通过外源性途径凝血比通过内源性途径凝血速度更快<1>.1.2 抗凝系 统的作用凝血过程是一个级联放大的瀑布效应,加之本身的正反馈作用,可以把最初生成的酶活性 增强至百倍.如此高的激活速度会对机体构成危险,就是说,此过程一旦启动,全身血液就会凝固 .此外,慢性异常血凝也会导致心肌梗死、脑血栓等严重疾病.因此,机体内的凝血作用必须保持 适度.事实上,血浆及血管内皮和其他组织中存在着许多抗凝物质,它们通过抑制或灭活凝血因子 的活性达到抵御血液凝固的目的.血浆中最重要的抗凝血物质是抗凝血酶Ⅲ和肝素,它们的作用约 占血浆全部抗凝血酶活性的75%.抗凝血酶Ⅲ是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂,而凝血因子Ⅱa、Ⅶ 、Ⅹa、Ⅸa、Ⅻa的活性中心均含有丝氨酸残基,都属于丝氨酸蛋白酶.抗凝血酶Ⅲ分子上的精 氨酸残基,可以与这些酶活性中心的丝氨酸残基结合,“封闭”了这些酶的活性中心而使之失活. 此外,血浆中还有其他抗凝血蛋白,如蛋白质C是通过灭活凝血因子Ⅴ和Ⅷ、限制因子Ⅹa与血小 板结合等机制起到抗凝血作用;蛋白S是通过激活蛋白质C进行抗凝<2>.1.3 纤维蛋白的 溶解血液中除了有抗凝系统之外还存在纤溶系统.所谓纤溶系统,是指能将血液凝固产生的纤维蛋 白重新溶解的系统,由纤溶酶原、纤溶酶和纤溶酶原激活剂组成.纤溶系统对于防止血栓形成和保 持血流通畅具有重要意义.纤维蛋白溶解过程分为两个阶段,即纤维蛋白酶原激活和纤维蛋白溶解 .纤溶酶原激活剂主要有血管激活物、组织激活物和激肽释放酶三类,它们的作用是水解纤溶酶原 ,使之成为纤溶酶.纤溶酶则是血浆中最活跃的蛋白酶,它具有水解多种蛋白质,如凝血酶、因子 Ⅴ、纤维蛋白原和纤维蛋白等,但其主要作用是水解纤维蛋白原和纤维蛋白,防止血管内出现血栓<3>(见附图).附图 血液凝固、抗凝与纤溶注:1实线为凝血途径;2 虚线为抗凝血、纤溶途径2 抗凝剂的种类、分子结构和作用方式除了血浆中的抗凝血物质以外,自 然界中还存在大量抗凝、溶栓效应的活性物质.尽管这些抗凝剂的来源、分子性质和结构差别很大 ,但它们的抗凝血作用方式是一致的,这些方式表现为三个方面,即抑制凝血因子活性、溶解纤维 蛋白以及阻碍血小板的凝聚.2.1 凝血酶及其相关凝血因子抑制剂在凝血反应过程中凝血酶不 仅将纤维蛋白原转化成纤维蛋白凝块,而且调节了血液凝固因子的活性,刺激血小板反应.凝血酶 直接影响了血管内皮细胞的止血功能,并调节了血细胞的非止血功能.因而,凝血酶抑制剂是调节 血液凝固以及调节各种复杂的凝血酶功能的有效工具<4,5>.以凝血酶以及激活凝血酶原的凝 血因子为底物的抑制剂,作用方式与抗凝血酶Ⅲ类似,都是通过封闭凝血因子活性位点从而抑制该 因子的活性.目前已发现的抑制凝血因子活性的抗凝蛋白有水蛭素、壁虱抗凝肽.2.1.1 水 蛭素(hirudin,HV) 水蛭素是从吸血动物水蛭的唾液腺分泌液中获取的一种具有抗凝 血作用的蛋白质,是目前发现的、最有效的凝血酶抑制剂.天然水蛭素是由65或66个氨基酸组成的单链多肽,其N末端富含半胱氨酸,半胱氨酸之间相互作用形成3个二硫键,使N端结合紧密;C 末端含有多个酸性氨基酸.水蛭素的N末端能封阻凝血酶与纤维蛋白原专一性作用的阴离子结合位点 R,而C末端有6个酸性氨基酸,它们可以与带正电的凝血酶识别位点形成许多离子键.N末端和 C末端两个功能区域以协同的方式结合到凝血酶上,在凝血酶的活性部位形成一个帽子,阻止凝血酶与底物的结合<6>.从发现水蛭素至今,共有3种异构体被纯化并命名:HV1,HV 2,HV 3.其中从口部提取的HV 2具有高效活性,而从头部提取的HV 1活性是HV 2的22%,从身体其他部位提取的HV 3几乎没有抗凝活性.由于水蛭素的稳定性高,在极端的pH和热条件下均能保持活性,加之抗凝作 用强烈,因此水蛭素在临床医学上有着广泛的应用前景<7,8>.近期研究证实,水蛭唾液腺分 泌蛋白中还有一些在结构上或者功能上与水蛭素有很大差别的抗凝蛋白,例如Therostas in,这是一种从Theromyzontessulatum中新发现的与HV结构不同但作用 相似的凝血酶抑制剂<9>.赵荣乐等人从盐源山蛭和蚌蛙蛭的头部也分离出了抗凝血蛋白,但其 抗凝血机制和分子结构还有待进一步的生物化学和分子生物学研究加以证实<10,11>.2. 1.2 壁虱抗凝肽(tickanticoagulantpeptide,TAP) 壁虱抗 凝肽是从非洲钝缘蜱属壁虱中分离的强效Xa因子抑制剂,其分子大小、结构类似于高效的凝血酶 抑制剂水蛭素.它是一个由60个氨基酸组成的单链酸性肽,含有6个半胱氨酸残基,但是在TAP的N末端拥有与Xa因子相互作用的关键基团:AsnArg leu.TAP是一种慢速但结合紧密的、有高效选择性的Xa因子抑制剂,它通过与Xa因子的结 合来阻止凝血激酶复合物的形成,从而抑制了凝血酶原的激活.对Xa因子潜在的和特异性的抑制 作用表明TAP能有效地治疗和预防血管闭塞疾病,可能成为预防血栓形成的有效药物<12,1 3>.2.2 以纤溶酶或纤维蛋白作为底物的抗凝剂天然抗凝血蛋白中种类最多的是以纤溶酶原 和血纤维蛋白作为底物的抗凝剂.这类抗凝剂以蛋白酶为主,其分布广泛,从细菌到哺乳动物中都 有发现.2.2.1 蚓激酶 蚓激酶即蚯蚓纤溶酶,是一组从蚯蚓体内分离出的具有抗凝血作用 的蛋白酶.自80年代初日本MiharaH等首次发现粉正蚓水提物中有直接溶解纤维蛋白以及 激活纤溶酶原的活性物质以来,至今已经从不同种类蚯蚓体内提纯出多种具有抗凝活性的蛋白组分 <14>.研究发现蚓激酶是一类复杂的蛋白酶,其复杂性表现在组分多样性、结构多样性、酶学 特性多样性几方面.同一种蚯蚓体内能分离出至少两种以上具有抗凝活性但是分子量和生化特征不 相同的蛋白酶.例如在粉正蚓、赤子胜爱蚓体内均分离出多种纤溶酶组分<15～17>.这些蛋 白酶不仅分子结构、分子量上不同,而且对底物作用方式和作用位点也有很大差别.粉正蚓的纤溶 酶中有的可以水解碱性氨基酸,有的可以水解酸性氨基酸;赤子胜爱蚓纯化的组分中有的可以直接 水解纤维蛋白,也有的以纤溶酶原作为水解底物.尽管如此,复杂的蚓激酶仍然具有一些可寻的共性,这些共性表现在以下三个方面:1对凝血过程的影响上,所有的蚓激酶都表现为仅对血液凝固后期阶段起作用,而对凝血因子Ⅴ,Ⅶ,Ⅷ,Ⅸ,Ⅻ无显著的影响;2 分子结构上,蚓激酶在分子量、氨基酸组成上有很大的差别,但是它们的N 末端氨基酸序列显示出蚓激酶与胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶具有一定的相似性,加之其水解底物方式也与这两种酶相似,提示蚓激酶可能属于丝氨酸蛋白酶类<18,19>.3 稳定性,蚓激酶在pH4～10的范围内都很稳定,同时也是一类热稳定性非常好的蛋白水解酶,5 0℃以下可以长久保持活性<20>.通过对蚓激酶药理学研究证实蚓激酶是一类具有强烈溶栓、 抑制血栓形成的蛋白酶,其毒副作用很小,是一种极具开发价值的溶栓药物.2.2.2 蛇毒纤 溶酶 蛇毒是含有多种生物活性蛋白质的混合物,其中包含有能够直接溶解纤维蛋白或纤维蛋白酶 原的蛋白酶,对于这类酶的研究不仅有助于阐明蛇伤中毒患者的血液变化病理机制,而且也为其应用开发提供理论基础.蛇毒纤溶酶的分布非常广泛,迄今为止在所有的响尾蛇
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