随着人类期望寿命的不断延长,越来越多的人受到AD(Alzheimer,5 disease)的威胁<’;。AD的病因及发病机制迄今尚未阐明。M一胆碱系统的功能降低虽 然不是原发病因,却是重要的中间环节。目前抗老年痴呆的西药主要就是针对这一环节的胆碱醋酶 抑制剂。中医认为阴虚气虚是老年虚症最常见的类型,也是AD病人常见的证侯群。本室以往的研 究发现,老年大鼠及脑内定位注射兴奋性氨基酸造成的拟痴呆大鼠,Y迷宫实验中逃避电刺激的正确率明显降低,滋阴药知母提取的活性成分zDY101对此有显著改善作用。研究还证实,ZDY 101这种作用的机理和现用的胆碱醋酶抑制剂不同,主要是促进脑内M受体的生成,从而提高其密 度,是一种毒副作用很低的、很有前途的新型抗老年痴呆药物lz>。由于过去还没有发现能提高脑M受体密度的药物,进一步研究ZDY101提高M受体的机理就成为我们关注的问题。 ZDY 101是一种环戊烷多氢菲。近年来,在抗AD的研究中,有环戊烷多氢菲结构的街体激素受到很多 人关注,尤其是雌激素。文献<3>、叫报道,雌激素能提高体外培养的神细胞存活期、抑制凋亡 、提高突触的生长力和可塑性。文献<5J、【61报道雌激素有益于改善更年期妇女的智力状态 ,对缓解情绪压力有效。雌激素替代疗法作为预防老年妇女AD的措施正在进行临床试验,尚无结论。因此ZDY101对M受体的调节作用是否通过雌激素受体是必须弄清楚的问题。本文以转基因的CHOm:细胞为作用对象,研究雌激素拮抗剂rel-- 1 827501,>对zDYlol提高离体细胞M受体有无拮抗作用;探讨zDY101是否通过雌激素受体途径发挥作用。材料与方法Ll试剂、材料 ,H一NMs比活度为3TBq·mmol一,(英国Alnersham)、ICI一1 82780(英国ToeriS Cookson公司)、阿托品(Sigma)、zDYlol(从知母生药提取和纯化,经质谱、 核磁共振谱、红外谱、旋光度等鉴定,纯度>95%)、MEM培养基(GIBCO)、pEI( 英国BDH)、玻璃纤维滤膜(国产红光69型),其余试剂为国产分析纯。LZ方法L2.1细 胞培养已转染MZ受体cDNA的cHomZ细胞在MEM培养基含10%小牛血清、0.1林m ol·L一’脯氨酸、4林mol.U‘谷氨酸和适量青链霉素)内,置于37℃、5%的COZ 培养箱中培养。细胞传代24h后加药,加药后60h收集细胞,用3H一NMs进行放射配基结合反应测定M受体密度。药物(ZDY 1 01、雌激素)溶解于二甲亚枫(DMSo),终浓度为1 xlo一smol·L一’,对照组加oMso。同时作平行组各加Iel一1 82780,终浓度为lxlo一5 mol·L一‘。nMso在培养基中的终浓度均调整至0.1%。L2.2受体密度的测定收集到的细胞弃培养基在保持细脚占壁清况下加KHB缓冲液(含10~卜L--’H印Es、1 lsnunol一L一INacl、4.3mmo一L一IKC一、1.17mmol·L一1 Mgso4·7HZO、1 .3mmol·L一leaclZ、25mmol·L一,N水eo3、1 1 .7mmol·L一,Glueose,pH 7.4),在37℃下温育30 min(去除内源性配基)后用冷的KHB缓冲液洗两次,饱和曲线特异结合各管加3H-NMs,终浓度0.1一1 .2 nmol.L一’;单点法特异结合各管全部加’H‘NMs至终浓度1 .2 Iunof一’。非特异平行管再另加10卿ol一’阿托品,反应总体积为0.2 mL,在37℃下摇床温育45 min后即置冰浴中,加lmL冰冷淋洗缓冲液刮下细胞,用水泵抽吸至玻璃纤维滤膜(预先用0.3%pEI浸过以降低非特异结合性)上,用冰冷磷酸缓冲液(10 mL)洗两次,80℃烘干后采用固相液体闪烁法测量放射性活度,微量Lowry法测定蛋白。L 2.3数据处理饱和曲线用自编RBA软件计算。单点法受体密度以每毫克蛋白结合的fmol( RT)值表示,按下式计算:RT(finol.mg’蛋白)二总结合(eounts·min 一’)一非特异结合(eounts·min一,)测量效率(%)x比活度(3TBq·mmol一‘)x标本蛋白量(mg)统计处理用两两比较法,实验时对照组和用药组配对进行,统计时采用配对卜检验。2结果2.IM受体的饱和曲线 本文所用的M受体测定方法有2种:一是用完整的贴壁培养细胞直接进行配基结合反应,二是采用亲水标记物3H-NMs,结果得到的典型的饱和曲线,非特异结合很低,3H一Ms浓度为1.2 nlnof一’基本达到饱和。已知该细胞株在M受体5种亚型中仅含MZ,所以测得的实际是M: 受体的饱和曲线(见图l)。减慢M受体密度的降低,培养到84h时,对照组密度为(88.3 出22.0)fmof·mg’蛋白(均数士标准差,下同),平行的雌激素组为121.8士2 3.3,尸<0.001。实验证明,zDY101也有类似功效,平行的对照组和用药组分别为94.0士23.4和146.9士34.8,尸<0.001,结果见图2。l的日口DMSOeolltro.DrUgtreated·一。月、﹄。苍8巴芝J。扮一s后GSPee一ficb一nd一ngZDY101 gro叩 图2Fig.2E2和zDY 101对M:受体密度的上调作用Both EZ and ZDYIOI showtheuP一regulationeffect ofM:reeeptor(n=10)。一。日口一︺比Non一sPee一五cb,nd一ng06 05 04 0302引nU nU fl CU八UO050 100 <下2 nmo一L一1图1 3H喇Ms测得的CH0mZ细胞MZ受体饱和曲线Fig一3H喇Ms satUration eurves were generated usi吧 CH0mZ eells2.2 znvioi对M:受体密度的调节 随着培养时间的延长,细胞开始衰老,表现之一为M受体密度下降。雌激素有神经保护作用,可2.3 ICI一182780的影响 Icl一1 82780被认为是一种雌激素拮抗剂。平行实验发现,不论是DMSO对照组、雌激素组或zny lol组,加人Iel一152780后,M受体密度都有明显下降,其中雌激素组的下降幅度最大(见表1)。表1中数据以均数士标准差表示,括号内为n数,**表示与平行的不加Iex一182780组比较,p<0.01。 进一步计算用药标本与平行对照标本下调幅度的差异,发现用雌激素的标本下调幅度显著大于用表1 Iel一152750对雌激素和znvlol调节CH0m:细胞M:受体密度的影响Tab一e 1 Effeetor一ex一ls27soofthereguIationactionorest radio一andznylolonMZreeeptororeHomZee一s(加01·mg一‘)雌激素Estradiol ZDY101DMSO对照(9)DMSO eontrol(9)雌激素组(9)Estradiol grouP(9)DMSO对照(9)DMSO control(9)ZDY 1 01组(9)ZDY101 grouP(9)不加ICI一182780No ICI一182780加ICI一1 82780Wlth ICI一1 8278089.6士229123.7士23.995.9士24.0147.3士36.966 乡土22.584.8士19.877.0士22.3120.8士40.4DMSO的标本,尸 二0.004,而用ZDY101后下调幅度与用DMSO的标本无显著差异,尸二0.2376(见图3)。60汕已50口W ithoUt ICI.WithICI 0八U 0 nU .络气J鸟‘l工ouIJ/﹄日d。。臼芝怡它召己 EZ grouP
zDY101 grouP 图3不同处理组细胞用ICI一182780引起的MZ 受体密度下调幅度Fig·3 Change ofMZ reeePtordensityinEZandZDYI01 grouP with or withoutICI一1827803讨论 (l)文献<8>报道培养液中加0.夕乡子一1%DMSO可使CHOm:细胞的M受体密度升高 约20%,其作用机理不明。DMSO不是雌激素激动剂,所以其升高M受体的作用不是通过EZ受体。本文结果表明,这种升高也可被ICI一182780抑制,所以ICI一182780很可能除占领EZ受体外,还有另外的结合位点,这与文献<9>、<10>的结论一致。因此在用Iel一1 82780探讨zDY101的作用是否通过EZ受体时,必须减去DMSO的影响。 (2渔然文献中近年来有关雌激素有神经保护作用的报道很多,但是有关其作用机理的研究很少涉及脑内胆碱能系统【川。本研究室前阶段工作发现aEZ和pEZ在终浓度为1卜5 mol·L一’时能显著提高cHom:细胞的M受体密度<’2>。本文结果证实了以前的结论, 并且证明雌激素这一作用的强度远超过oMSO。用ICI一182780后盯值的降低平均达到 40fmof·mg一’蛋白,扣除DMso的影响后雌激素仍有显著升高M受体的作用,说明雌激素提高M受体密度很可能是通过相关的核受体实现的。(3)本文结果显示zDY101也能提高CHOmZ细胞的M受体密度,提高的幅度达到50fm叨mg蛋白。同时用ICI一1 82780也能使M密度有所降低,但降低的幅度不到30 fmoFmg蛋白,和Iel一182750通过DMSO引起的M密度降低无显著差异。也就是说,ICI一1 82780对ZDYlol组M受体的降低作用实际上是降低了其中DMSO引起的M受体升高,对ZDY 101本身引起的M受体升高并无抑制作用
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