助孕3号方及拆方防治肾虚黄体抑制动物流产模型的实验研究

自然流产(简称sA)是指胎儿尚无独立生存能力时,未经人工方法,胎儿或胎盘自动脱离母体而排 出‘¨。SA是一种常见的妊娠病,且有反复发生的倾向。黄体功能不全是引起sA的一种常见病 因,其中医证候主要表现为肾虚或脾肾两虚。临床上我们用助孕3号方治疗先兆流产患者,治愈率 达80%。为探讨本方的作用机理,特别是在防治黄体功能不全性流产方面的机理,特设立了本实 验研究。本实验对妊娠大鼠以羟基脲和米非司酮建立肾虚黄体抑制病证结合动物流产模型,从血清 孕酮(P)水平、子宫卵巢组织形态学变化及子宫蜕膜孕激素受体mRNA的含量等方面探讨助孕3号方的作用机理。材料和方法一、动物及药物 选用健康、未产、10～12周龄、体重约180～220g左右有生育力的一级SD大鼠65只( 雌性45只,雄性20只),由第一军医大学实验中心提供。中药水提浓缩液:助孕3号全方由菟 丝子、川断、桑寄生、黄芪、党参等8味中药组成。助孕3号拆方补肾方由菟丝子、川断、桑寄生 等4味中药组成。健脾拆方由黄芪、党参等4味中药组成。按助孕3号方全方及拆方补肾方和拆方 健脾方的药物组成,准确称量每味中药,水提两次,过滤并浓缩,4。c保存。根据组方其药量分别为助孕3号方3.3g/mL、补肾方1.6 g/mL、健脾方1.8 g/mL。 二、实验方法及步骤 依据随机数字表将45只雌鼠随机分为6组,其中A(助孕)组、B(补肾)组、c(健脾)组各8 只,D(黄体酮对照)组、E(模型)组、F(正常对照)组各7只,称重并做标记。每日早晨阴 道涂片观察动情周期,于动情期(阴道脱落细胞为大量角化细胞)雌雄鼠1:1或2:l合笼。每日早晨观察雌鼠阴栓或阴道涂片,发现阴栓或阴道涂片看见大量精子计为妊娠d1。在建立模型的同时,d 1～d 10,A、B、C组分别灌服助孕3号方、补肾方、健脾方水提浓缩液2 mL和羟基脲(450 mg/kg)。D组灌服羟基脲并隔日肌注黄体酮(4 mg/kg),E组为模型组,灌服羟基脲和生理盐水,F组则为非模型健康有生育力雌鼠,灌服生理盐水。(根据大白鼠与人的药量换算公式<2’,按每只大鼠体重200 g,每目灌胃2 mL进行计算,浓缩后每只大鼠每天的中药量相当于50 kg体重的人二剂/d的药量。大鼠黄体酮的用量相当于50 kg体重的人40mg,隔日肌注一次。)d 10,A、B、C、D、E组均灌服米非司酮(3.75 mg/kg),F组灌服等量生理盐水。每组动物在合笼前、孕d10(灌服米非司酮前)及孕d1l均眼眶后静脉取血,保留血清待测孕激素水平并于孕d ll取血后乙醚麻醉下解剖,剪取子宫、卵巢,记录正常胚胎数和流产胚胎数,将一侧子宫立即放入固定液<4%多聚甲醛/O.1 mmol/L PBs含1/1 000焦碳酸二乙酯(DEPC)>中固定,固定时间不超过12 h。固定后的子宫放入已消毒的冻存管中,液氮保存待测孕激素受体mRNA。另一侧子宫和双侧卵巢用10%福尔马林固定后作病理检查。 三、正常胚胎、流产胚胎的判定标准 正常胚胎:宫内未见瘀血,胚胎淡红色。 流产胚胎:解剖时子宫呈“竹节状”,宫内胚胎呈黑褐色。 流产率一秆蘸群‰ 四、孕酮检测方法 采用酶联免疫法检测血中孕酮(P)(试剂盒均由加拿大公司中国总代理北京倍爱康生物技术有限公司提供。试剂批号:19A)。 五、孕激素受体mRNA的含量 用原位杂交的方法检测子宫蜕膜中孕激素受体(PR)mRNA的含量,原位杂交检测试剂盒由武汉博士德生物工程有限公司提供。 具体操作方法:①常规脱水,浸蜡,包埋,切片,厚度6～8 pm。②石蜡切片经常规脱蜡至水。⑧3%H:0:室温处理10 min以灭活内源性过氧化物酶。蒸馏水洗涤2次。④暴露mRNA核酸片段:切片上滴:0Ⅱ3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶(1 mL 3%柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶,混匀),37℃消化15 min。⑤:陨杂交:湿盒的准备——干的杂交盒底部加2()%甘油20 mL以保持湿度。按每张切片20弘L加预杂交液。置37～40℃恒温箱2～4 h,吸取多余液体,不洗。⑥杂交:每张切片加上20弘L杂交液后,揭去原位杂交专用盖玻片的保 护膜,盖在切片上。37～40℃恒温箱杂交过夜。⑦杂交后洗涤:揭掉盖玻片,30～37℃的2×SSc液洗涤5min 2次;O.5×SSC洗涤15 min1次;O.2×SSc洗涤15min’1次。⑧滴加封闭液后:37℃30min,甩去多余液体,不洗。⑨滴加生物素化鼠抗地高辛,37℃60 min后,O.5 mmol/L PBs洗 一18～涤5 min 4次。⑩滴加SABC,37℃20 min后,o.5mmol/L PBS洗涤5 min 3次。⑧滴加生物素化过氧化物酶,37℃20 min后,O.5mmol/L PBS洗涤5min 4次。⑩DAB显色;使用DAB显色试剂盒——1 mL蒸馏水加显色试剂A、B、C各一滴,混匀,加至标本上,显色20～30 min,充分水洗。⑩苏木素复染,充分水洗。⑧酒精脱水,二甲苯透明,封片。 以未加探针的切片作阴性对照。 六、结果判定L80 阳性信号的评定:原位杂交阳性信号位于胞浆内,呈棕黄色颗粒状,信号越强,颜色越深。未加探针的阴性对照片中无阳性信号。阳性等级按以下方法计算: 阳性细胞数:≤10%,记1分;≤30%,记2分;≤70%,记3分;>7()%,记4分。 阳性着色强度判断标准:弱一1分;中=2分;强=3分。 上述两种计分相加,1～3分为阴性,4～5分为阳性,6～7分为强阳性。 七、统计学方法. 孕酮含量的比较采用￡检验,流产率和孕激素受体mRNA的比较采用四格表X。检验。结 果 一、各组大鼠流产情况 表1可见E组流产率最高,为82.1%,F组流产率最低,为12.7%,A、B、c、D组流产 率居中,经统计学处理,A、B、c、D、E各实验组的流产率与F组的流产率相比有显著性差异 (P<().01),均高于F组。c、D两组流产率与E组相比无显著性差异(P>0.05) 。A、B两组流产率与E组相比有显著性差异(Po.05)。妊娠d 10,A、B、c、D、E各组与正常妊娠组(F组)P值比较,除E组与F组有显著性差异(P< ().01)外,A、B、c、D各组与F组均无显著性差异衰1各组大鼠流产情况比较Tnblel AhOrtiOn rate by gI‘Oupal PO.05)。妊娠d 10,A、B、C、D各组与造模组(E组)的P值比较均有显著性差异(Po.05)外,A、C、D、E各组与F组均有显著性差异(PO.05),A、B两组与E组均有显著性差异(P<0.05)。 三、孕激素受体 从表3可见孕激素受体阳性率F组最高,E组最低,A、B组较高,C、D组较低。A、B、F组与E组比 表2孕酮的变化(;士s)(nmol/L)Tnble 2 Change 0f progesteron leVel by grOup*l P
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