大鼠在体肠吸收实验是经典的研究药物吸收的体内方法 ,能在动物保持完整的血循环、神经系统和代谢功能的情况下获得动力学数据 ,且该法可精确控制浓度 ,ｐＨ ,渗透压 ,吸收范围和流速等因素<1,2 > 。在体肠吸收法一般用于考察游离药物的吸收机制 ,对于脂质体等剂型的吸收研究报道较少。我们采用旋转薄膜 超声法制备的环孢素纳米脂质体在家兔体内吸收良好<3> ,与环孢素微乳软胶囊 (商品名 :新山地明 ,ＳａｎｄｉｍｍｕｎＮｅｏｒａｌ)生物等效 ,并对纳米脂质体的在体内分布行为<4 > 进行了考察。本研究应用在体肠吸收实验进一步研究纳米脂质体的吸收机制。材料和方法仪器 ＺＦＱ85Ａ型旋转蒸发仪 (上海医械专机厂 ) ;超声波细胞粉碎机 (宁波新芝科器研究所 ) ;ＨＬ 2恒流泵 (上海沪西分析仪器厂 ) ;岛津ＬＣ 5Ａ高效液相色谱仪 (日本 )。药品 环孢素 (ＵＳＰ 2 3,批号 :0 4 0 396 ,捷克Ｇａｌｅｎａ公司 ) ;大豆磷脂 (纯度 >80 % ,批号 :980 6 0 7,上海浦江磷脂有限公司 ) ;2 ,4 二硝基苯酚 (ＤＮＰ ,分析纯 ,进口分装 ) ;维拉帕米 (连云港恒瑞制药厂 ) ;环孢素微乳软胶囊 <瑞士诺华制药有限公司生产 ,进口注册证号 :Ｘ 970 2 0 3,批号 :32 2ＭＦＤ 0 5 98,每粒 2 5ｍｇ>。动物 ＳＤ大鼠 (中国药科大学实验动物中心 ) ,雌雄不限。环孢素纳米脂质体的制备 定量称取大豆磷脂 4 0 0ｍｇ ,胆固醇 10 0ｍｇ和环孢素 37.5ｍｇ置梨形瓶中 ,加入氯仿 甲醇 (1∶1)使溶 ,减压蒸发除去溶剂 ,使大豆磷脂等在瓶壁形成均匀的薄膜。然后在烧瓶中加入 0 .9%氯化钠溶液 10ｍＬ ,水合 1ｈ即得脂质体粗混悬液。在冰水浴条件下探针式超声 2 0ｍｉｎ得到呈半透明带浅蓝色乳光的环孢素纳米脂质体胶体溶液<4 > 。环孢素的ＨＰＬＣ测定方法 采用反相ＨＰＬＣ测定药物含量。具体条件为 :色谱柱 ,ＳｐｈｅｒｉｓｏｒｂＣ 8(4 .6ｍｍ× 15 0ｍｍ ,中科院大连化学物理研究所 ) ;流动相 ,甲醇∶乙醚∶水∶磷酸 (35 0∶10∶14 0∶1) ;柱温 ,70°Ｃ ;流速 ,1.2ｍＬ·ｍｉｎ- 1;柱压 ,6 0ｋｇ·ｃｍ- 2 ;检测波长 ,ＵＶ 2 10ｎｍ ;进样体积 ,2 0 μＬ。空白辅料、回流液的色谱图在药物出峰位置未见其他杂质峰 ,说明对药物测定无干扰。含量测定时峰面积Ａ与浓度Ｃ(ｇ·Ｌ- 1)标准曲线方程为 :Ａ =8.2 7× 10 3Ｃ - 12 9.71(ｒ =0 .9999)。线性范围 0 .5～ 10 ｇ·Ｌ- 1,环孢素高、中、低 3种浓度时的回收率分别为 (98.5±1.9) % ,(99.1± 2 .1) % ,(99.0± 1.8) % ,平均日内差及日间差分别为 1.5 %和 2 .0 %。在体小肠吸收 手术前大鼠空腹约 12ｈ ,手术参照大鼠在体回流实验的手术方法<5,6 > 。大鼠称重 ,用2 0 %乌拉坦溶液麻醉 ,在大鼠腹部打开约 3ｃｍ的开口 ,找到空肠段 ,两端插管并结扎 ,与微量输液泵连接 ,形成回流回路。以带刻度的 10ｍＬ量筒为贮液容器。按 5ｍＬ脂质体·ｋｇ- 1给药 ,移取脂质体至量筒 ,用生理盐水加至刻度。以开始回流液入肠为零时间 ,分别在 10 ,30 ,6 0 ,90 ,12 0ｍｉｎ读取液面刻度线 ,用长针管缓慢推注 2 0ｍＬ空气入量筒 ,使回流液混合均匀 ,取样 5 0 μＬ ,并被加 5 0 μＬ空白回流液。取出的样品用无水乙醇稀释 10 0倍后 ,进ＨＰＬＣ系统分析测定。回流结束后取下结扎的空肠段 ,测量其面积。给药与取样 制备浓度分别为 1,1.5 ,3.2 ,3.8,7.5ｇ·Ｌ- 1的环孢素纳米脂质体溶液 ,采用大鼠在体回流法测定各个浓度的脂质体 2ｈ内在在体大鼠小肠的吸收速率。以脂质体浓度为横坐标 ,各浓度时的吸收为纵坐标作图 ,通过药物浓度与吸收速率之间的关系研究脂质体在大鼠小肠的吸收方式。每组实验用 6只大鼠。1 载体竞争剂的影响 制备磷脂浓度为 15 ｇ·Ｌ- 1的空白脂质体溶液 ,先以此溶液在大鼠空肠回流0 .5ｈ ,然后换上用此空白脂质体溶液稀释含药脂质体至 10ｍＬ ,同上法回流 2ｈ ,读数、取样、测定。2 Ｎａ+浓度的影响 将生理盐水中Ｎａ+浓度从15 4ｍｍｏｌ减低至 2 0ｍｍｏｌ,以抑制与Ｎａ+ Ｋ+泵有关的能量产生 ,另加入 134ｍｍｏｌ的Ｋ+调节至等渗。用Ｎａ+浓度为 2 0ｍｍｏｌ的生理盐水将含药脂质体稀释至 10ｍＬ ,同上法回流 2ｈ ,读数、取样、测定。3 能量抑制剂的影响 在回流液中加入 1ｍｍｏｌ能量抑制剂ＤＮＰ ,同上法回流 2ｈ ,读数、取样、测定。4 Ｐ 糖蛋白抑制剂的影响 在回流液中加入 1ｍｍｏｌＰ 糖蛋白抑制剂维拉帕米 ,同上法回流 2ｈ ,读数、取样、测定。结果脂质体在大鼠小肠的累积吸收量与脂质体浓度之间的关系 当脂质体中药物浓度从 1ｇ·Ｌ- 1逐渐增至2 .4 ｇ·Ｌ- 1时 ,累积吸收量从 (0 .0 2 5± 0 .0 2 4 )ｍｇ·ｃｍ- 2 增至 (0 .0 6 7± 0 .0 0 7)ｍｇ·ｃｍ- 2 ,但当浓度继续增至 7.5 ｇ·Ｌ- 1时 ,累积吸收量缓慢增至 (0 .0 85±0 .0 11)ｍｇ·ｃｍ- 2 ,呈现饱和现象 ,见图 1。图 1 环孢素纳米脂质体在大鼠小肠的累积吸收量与脂质体的浓度关系 (ｎ =6 ) Ｆｉｇ 1 Ｔｈｅｒｅｌａｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆｃｙｃｌｏｓ ｐｏｒｉｎａｎｄｔｈｅａｃｃｕｍｕｌａｔｅｄａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ给予空白脂质体、降低Ｎ ａ+浓度、给予ＤＮＰ和给予维拉帕米后环孢素纳米脂质体在大鼠小肠的累积吸收量的改变 对各组数据进行组间ｔ检验,结果表明 :使用空白脂质体作为载体竞争剂和降低Ｎａ+浓度的方法 ,使得累积吸收量分别从 (0 .0 90± 0 .0 2 0 )ｍｇ·ｃｍ- 2 变为 (0 .12± 0 .0 3)ｍｇ·ｃｍ- 2 和 (0 .0 70±0 .0 2 0 )ｍｇ·ｃｍ- 2 ,差异无显著意义 (Ｐ >0 .0 5 ) ;应用能量抑制剂ＤＮＰ和Ｐ 糖蛋白抑制剂均使累积吸收量增至 (0 .15± 0 .0 3)ｍｇ·ｃｍ- 2 ,差异有非常显著意义 (Ｐ <0 .0 1) ,见图 2。图 2 给予空白脂质体、降低Ｎａ+浓度、给予二硝基苯酚和给予维拉帕米后环孢素纳米脂质体在大鼠小肠的累积吸收量改变 (ｎ =6 , ｘ±ｓ) Ｆｉｇ 2 Ｔｈｅｉｎｆｌｕｅｎｃｅｏｆｃａｒｒｉｅｒｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ,ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔ ｉｏｎｏｆＮａ+,ｄｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌａｎｄｖｅｒａｐａｍｉｌｏｎｔｈｅａｃｃｕｍｕｌａｔｅｄａｂｓｏｒｐｔｉｏｎｏｆｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ□ :纳米脂质体。 2组比较经ｔ检验 :ａＰ >0 .0 5 ,ｃＰ <0 .讨论从本研究来看 ,空白脂质体对环孢素纳米脂质体在在体大鼠小肠的吸收没有显著影响 ,如果环孢素纳米脂质体的吸收需要载体 ,空白脂质体将抑制其吸收 ,可见环孢素纳米脂质体的吸收不依赖载体。Ｎａ+浓度对环孢素纳米脂质体的吸收没有显著影响 ,因此该脂质体的吸收非Ｎａ+依赖。Ｐ 糖蛋白抑制剂维拉帕米显著增加环孢素纳米脂质体的吸收 ,表明包封在脂质体中的环孢素仍可能受到Ｐ 糖蛋白的排放 ,而Ｐ 糖蛋白通过对维拉帕米的排放 ,减少对环孢素的排放而增加其吸收。能量抑制剂ＤＮＰ显著地增加了脂质体的吸收 ,可能因为一方面脂质体的吸收不需要能量 ,另一方面ＤＮＰ通过抑制Ｐ 糖蛋白对药物的排放作用增加吸收 (Ｐ 糖蛋白对药物的排放是能量依赖的<7> )。综上所述 ,环孢素纳米脂质体在在体大鼠小肠的吸收随浓度的增加有饱和现象 ,该过程不需要载体 ,非Ｎａ+依赖 ,非能量依赖。由此推测环孢素纳米脂质体在在体大鼠小肠的吸收是通过淋巴系统吞噬作用进行的。本实验通过定量的方法对吸收机制进行推测 ,如果能够结合激光共聚焦成像技术对吸收的全过程进行跟踪 ,可能更有益于对吸收机制的阐明大鼠在体肠回流法研究环孢素纳米脂质体的吸收行为@陈颖$中国药科大学药剂教研室!江苏南京210009
@平其能$中国药科大学药剂教研室!江苏南京210009
@郭健新$中国药科大学药剂教研室!江苏南京210009
@吴涛$中国药科大学药剂教研室!江苏南京210009
@高静$中国药科大学药剂教研室!江苏南京210009环孢素;;纳米脂质体;;小肠;;吸收;;大鼠目的 :研究环孢素纳米脂质体在大鼠小肠的吸收行为。方法 :利用旋转薄膜 超声法制备环孢素纳米脂质体。采用大鼠在体回流法研究脂质体在大鼠小肠的吸收行为。结果 :当脂质体中药物浓度从 1g·L- 1逐渐增至 2 .4 g·L- 1时 ,累积吸收量从(0 .0 2 5±s 0 .0 2 4 )mg·cm- 2 增至 (0 .0 6 7± 0 .0 0 7)mg·cm- 2 ,但当浓度继续增至 7.5 g·L- 1时 ,累积吸收量缓慢增至 (0 .0 85± 0 .0 11)mg·cm- 2 ,呈现饱和现象。使用载体竞争剂和降低Na+浓度 ,对累积吸收量没有显著影响 (P >0 .0 5 ) ;应用能量抑制剂 (二硝基苯酚 )和P 糖蛋白抑制剂 (维拉帕米 )均使累积吸收量从 (0 .0 90± 0 .0 2 0 )mg·cm- 2 增至 (0 .15
More abstracts about the 大鼠在体肠回流法研究环孢素纳米脂质体的吸收行为