随着我国人口老龄化现象日趋严峻 ,老年人常见的脑血管疾病如脑动脉硬化、脑梗死等是造成痴呆或认知功能减退的重要因素之一 ,严重影响了老年人的健康和生活质量。近年来研究认为 ,脑缺血再灌注所致的学习记忆功能的下降是由多种因素综合作用的结果 ,主要是由于机体氧应激损伤<1> 、兴奋性氨基酸介导的钙超载、线粒体功能障碍<2 > 等因素最终导致海马区神经元的迟发性死亡 (delayedneuronaldeath ,DND)。二苯乙烯苷 (2 ,3,5 ,4′ tetra hydroxystilbene 2 O β D glucoside)是蓼科蓼属植物何首乌 polygonummultiflorumthunb的主要成分之一 ,是一种多羟基酚类化合物。我室在前期研究工作中发现 ,二苯乙烯苷对 β 淀粉样蛋白、叠氮钠和H2 O2 致SK N SH神经细胞损伤模型中具有较好的保护作用。本文拟观察二苯乙烯苷对缺血再灌注沙土鼠脑组织NMDA受体活性的影响 ,同时观察二苯乙烯苷对小鼠急性脑缺血再灌注神经细胞内游离钙离子的影响 ,初步探讨二苯乙烯苷的脑保护作用机制。1 材料与方法1.1 试剂和仪器 二苯乙烯苷 (本室自制 ,从何首乌中提取分离 ,纯度为 72 % ) ;海得琴 (中国迈特发公司 ,进口药品许可证 :BX19990 12 5 ) ;Fluo 3/AM(购自北京乐泰生物公司 ) ;人工脑脊液 (mmol/LNaCl 12 4 ,KCl 2 ,MgSO4 1 8,CaCl2 1 6 ,NaH2 PO1 2 5 ,D glucose 10 ,NaHCO32 6 ) ;NEN 972 ,(Dupout NEN公司产品 ,比活性 884 3GBq/mmol。组织匀浆器 (PT MR16 0 0E ,瑞士 ) ,高速冷冻离心机(DupoutT2 1,美国 ) ,液体闪烁仪 (FJ10 7 P ,西安 ) ,振动切片机 (ZQP 86 ,购自浙江象山精密仪器厂 ) ,激光扫描共聚焦显微镜 (Bio RadMRC10 2 4 ,美国 ) ,倒置显微镜 (NikoneclipseTE30 0 ,日本 ) ,图像分析(LarserSharp ,美国 )。1.2 实验动物 沙土鼠 ,♀♂不拘 ,体重 5 5～ 70 g ;♂性昆明小鼠 ,体重 2 2～ 2 8g ;均购自首都医科大学动物实验中心 (许可证号 :京动许 (1999)市管会第0 13号 )。1.3 分组和造模 沙土鼠随机分为假手术组、模型对照组、二苯乙烯苷小剂量 (0 0 38g·kg- 1)、中剂量(0 114g·kg- 1)、大剂量 (0 342g·kg- 1) 5组。给药体积为 10ml·kg- 1,实验前连续灌胃给药 6d ,假手术组及模型对照组分别给予等量的自来水。d 7进行手术造模 ,造模采用改良levine<3> 法 :手术当日空腹给药 1h后 ,腹腔注射 10 %水合氯醛麻醉后将小鼠仰卧固定于平板上 ,碘伏消毒颈部。颈正中切口 ,用小型止血钳轻轻分离甲状腺及气管前肌肉 ,在显微镜下用玻璃分针将双侧颈总动脉与迷走神经、静脉分离后 ,用动脉夹夹闭 10min ,小心撤去动脉夹实现动脉再灌注。假手术组处理方法同上 ,但不夹闭动脉。术后d 8处死取前脑进行NMDA受体结合力实验。小鼠随机分为假手术组、模型组、海得琴组 (阳性对照 )、二苯乙烯苷小剂量 (0 0 38g·kg- 1)、中剂量 (0 114 g·kg- 1)、大剂量 (0 342 g·kg- 1) 6组 ,每组取 4只小鼠制作脑片 ,造模方法同上 ,但夹闭双侧颈总动脉 10min ,再灌注 15min后迅速断头取脑 ,放入通有 95 %的CO2 和 5 %O2 的预冷的人工脑脊液中 ,制备脑片进行神经细胞内游离钙离子测定。1.4 NMDA受体结合力测定 脑组织按 1∶10 (W /V)加入Tris HAc缓冲液 (TAB ,5 0mmol·L- 1,pH7 4 ) ,在冰浴中匀浆 ,用TAB洗涤 ,低温离心 (4℃ ,12 0 0 0r·min- 1,30min) ,弃去上请 ,再将沉淀冻存于 - 70℃ ,此即为脑突触粗膜 ,简称突触膜。膜蛋白含量按Lowry法测定。用 5 0mmol·L- 1TAB稀释突触膜 ,调整蛋白浓度为 1～ 2g·L- 1。特异结合管中加入 10 0 μl稀释液和 2 0 0 μl 5 0mmol·L- 1的TAB ,非特异结合管中加入 10 0 μl稀释液及 10 0 μl30 μmol·L- 1的MK80 1和 10 0 μl 5 0mmol·L- 1的TAB ,每管加入 0 1μCi3H MK80 1。每个样品做平行双管 ,30℃孵浴 30min。反应结束后 ,用预冷的5 0mmol·L- 1的TAB 5ml,抽滤于纤维滤膜上 ,并用预冷的 5 0mmol·L- 1的TAB 2 0ml分 3次洗涤。将滤膜置于闪烁杯内 ,加入Triton甲苯闪烁液 7 0ml,于液体闪烁仪上测定cpm值。计算公式 :特异性结合cpm =(样品总结合cpm -非特异结合cpm) /总计数cpm×每管配基的克分子数 /样品蛋白的mg数。1.5 神经细胞内游离钙离子测定 将动物的新鲜脑放入通有 95 %的CO2 和 5 %O2 的预冷的人工脑脊液中 ,在振动切片机上切出 4 0 0 μm厚度的脑片(位置在冠状面后 15 0 0 μm) ,置于CO2 培养箱中 ,37℃孵育 30min后 ,加入 5 μmol·L- 1的Fluo 3/AM5 0 0 μl,在CO2 培养箱中负载 1h后 ,以人工脑脊液冲洗 3次 ,在激光扫描共聚焦显微镜 (LSCM )上进行光切 ,观察不同层面皮层和海马区细胞内游离钙的荧光强度。Fluo 3/AM钙荧光指示剂不能直接与钙结合 ,只有当通过细胞膜时 ,在膜上酯酶作用下出去酰基 ,释放出Fluo 3,才能与细胞内游离的钙离子结合产生绿色荧光。荧光的强弱反应细胞内游离钙的水平高低。调整激光扫描共聚焦显微镜 (LSCM )激发波长为 4 88～ 5 15nm ,光切参数 :Zstart =0 μm ;Zstop =15 0 μm ;Zstep =10 μm ;Kalman =6 ;物镜 4×。通过光切 ,观察不同层面皮层和海马区细胞内游离钙的荧光强度。利用LaserSharp图像处理系统 ,测定区域面积及荧光强度 ,以单位面积荧光强度为指标 ,观察海马、皮层不同层面的细胞内游离钙的水平<4 > 。1.6 统计方法 采用SPSS10 0统计软件进行数据统计 ,通过单因素方差分析进行显著性检验。2 结果2 .1 二苯乙烯苷对缺血再灌注沙土鼠前脑NMDA受体结合力的影响 3H MK80 1与受体的特异性结合力代表了NMDA受体的活性。实验结果显示 ,沙土鼠脑缺血再灌注模型组前脑组织NMDA受体结合力比对照组增加了 4 0 5 % ,而二苯乙烯苷小、中剂量组的受体结合力比模型组降低 ,表明二苯乙烯苷能抑制模型组动物的NMDA受体活性 (Tab 1)。Tab 1 Effectoftetrahydroxystilbene (THS)onNMDAreceptorsinforebrainofischemiagerbils( x±s)Group Dose/g·kg- 1 n fmol/mg- 1 ProShamcontrol 845 6.74± 3 3 .81 Ischemiamodel 764 1.12± 2 4.0 4Model+THS 0 .0 3 88619.2 2± 3 5 .10Model+THS 0 .114 85 62 .5 2± 17.72 Model+THS 0 .3 42 8664 .5 5± 3 4.5 2 P <0 0 5vsischemiamodelgroup2 .2 二苯乙烯苷对缺血再灌注小鼠神经细胞内游离钙离子的影响 实验结果显示 ,小鼠急性脑缺血再灌注模型组脑皮层和海马区神经细胞Ca2 +浓度比对照组明显升高 ,而二苯乙烯苷各剂量组神经细胞Ca2 +浓度均比模型组降低 ,表明二苯乙烯苷可以抑制缺血再灌注所致的钙超载 (Tab 2 )。3 讨论近年来研究认为 ,反复脑缺血发作所致的脑组织损伤是由多种因素综合作用的结果 ,其中兴奋性氨基酸及其受体 (主要是NMDA受体 )介导的钙超载是导致脑组织损伤的主要因素之一<5,6 > :CA1区神经元上分布着大量的兴奋性氨基酸的受体 ,而抑制性的神经支配分布很少。谷氨酸作为一种主要Tab 2 Effectoftetrahydroxystilbene (THS)onintracellularcalciumionsinbrainofischemiamice( x±s,n =4)Group Dose/g·kg- 1Cortical(Pix/μm2 )Hippocampus(Pix/μm2 )Shamcontrol 0 .414± 0 .2 65 0 .472± 0 .2 10 Ischemiamodel 0 .973± 0 .1860 .83 8± 0 .2 84Model+Hydegin 0 .470± 0 .13 7 0 .44 1± 0 .2 0 7 Model+THS 0 .0 3 80 .474± 0 .2 65 0 .499± 0 .10 1 Model+THS 0 .114 0 .44 8± 0 .10 9 0 .45 8± 0 .14 5 Model+THS 0 .3 42 0 .5 93± 0 .1
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