Ghrelin是胃黏膜合成的由 2 8个氨基酸残基组成的促生长激素释放肽 (growthhormonereleasingpep tide ,GHRP) ,2 0 0 0年发现其是生长激素促分泌素受体 (growthhormonesecretagoguereceptor,GHS R)的内源性配体。GHS R是含有 7个跨膜区域的G 蛋白偶联的孤儿受体。ghrelin与下丘脑及垂体中GHS R结合后 ,通过神经肽Y介导促进生长激素释放 ,参与机体能量代谢调节。GHS R在体内分布非常广泛 ,在心血管组织中亦有大量分布 ,提示ghrelin可不依赖于中枢神经系统而直接与外周受体结合后发挥生物学效应<1> 。近年研究还证明ghrelin具有明显的心血管保护作用 ,如心力衰竭大鼠补充外源性ghrelin后增强了心脏收缩功能 ,改善了血流动力学障碍<3> ;我们先前的研究表明 ,外源性补充ghrelin明显减轻了败血症休克大鼠的心脏功能障碍和心肌损伤<5> 。这些结果均提示ghrelin可能具有特殊的心脏保护作用。本研究观察了ghrelin灌流对大鼠离体心脏缺血再灌注 (ischemia/reperfusion ,I/R)损伤的影响 ,并观察缺血及I/R的心肌ghrelin受体结合改变 ,以期探讨ghrelin的直接心脏保护作用及其可能机制。1 材料和方法1 1 材料 ♂Sprague Dawley大鼠 2 0 0～ 2 5 0g ,购于北京大学医学部实验动物中心。大鼠ghrelin及12 5I His9 ghrelin均由美国PhoenixPharmaCo提供。ATP测定试剂盒、EDTA、N aF、胰蛋白酶抑制剂、抑肽酶及胃蛋白酶抑制剂A等为SigmaCo产品。其余试剂均为市售分析纯产品。12 方法1 2 1 离体大鼠心脏灌流 参照Merin等<6 > 的方法进行。简言之 ,乌拉坦 (1g·kg- 1,ip)麻醉后 ,开胸 ,迅速取出心脏 ,于Langendorff心脏灌流装置主动脉逆行灌注Krebs Henseleit(K H)缓冲液预灌流 ,灌流液恒温 (37℃ )、恒压 (80cmH2 O) ,并为 95 %O2 - 5 %CO2 饱和。从左心耳插入带球囊导管 ,经换能器在生理多导记录仪上记录最大左心室收缩压 (LVSP)、舒张压 (LVDP)和最大压力变化速率 (±LVdp/dtmax)值。预灌流 10min后 ,离体心脏随机分为下述各组(每组n =8) :①对照组持续灌注K H液 6 0min ;②缺血再灌注组 (I/R组 )停灌 30min(保温、保湿 )后 ,再灌注K H液 30min ;③～⑤组为I/R+ghrelin组 ,灌流操作同I/R组 ,但再灌注液中分别含有ghrelin 1× 10 - 10 、1× 10 - 9和 1× 10 - 8mol·L- 1。分段收集流出液以计算冠脉灌流量 (CPF)和测定心肌乳酸脱氢酶 (LDH) <7> 及肌红蛋白 (Mb) <8> 漏出量。灌流结束后 ,迅速将心脏在液氮中冻存 ,分别取心尖部心肌按巴比妥酸法测定脂质过氧化终产物丙二醛 (MDA)含量<9> ,按试剂盒操作测定左心室心肌ATP含量<10 > 。1 2 2 另取大鼠 15只 ,随机均分为对照组、单纯缺血 30min组及缺血 30min再灌注 30min组 ,按上述方法灌流 ,灌流结束后取心室肌用于ghrelin受体测定。1 2 3 大鼠心肌浆膜制备及标志酶测定 根据Tang等<11> 的方法制备心肌肌浆膜。简言之 ,用 5倍体积缓冲液A (5 0mmol·L- 1NaH2 PO4 /Na4 P2 O7,pH7 4 ,10mmol·L- 1EDTA ,2 5mmol·L- 1NaF ,1μg·L- 1胰蛋白酶抑制剂 ,1mg·L- 1抑肽酶 ,0 75mg·L- 1胃蛋白酶抑制剂A)Polytron上匀浆 ,14 0 0 0×g离心 2 0min。用缓冲液B (0 6mol·L- 1NaCl,5 0mmol·L- 1NaH2 PO4 /Na4 O2 O7,pH 7 4 ,10mmol·L- 1EDTA ,和 2 5mmol·L- 1NaF)重悬沉淀 ,再次匀浆后14 0 0 0×g离心 2 0min。沉淀用缓冲液A重悬 ,再匀浆 3次后 ,2 30 0×g离心 15min ,重复匀浆及离心 1次。上清再用 7970 0×g离心 4 0min ,所得沉淀用缓冲液C (1mol·L- 1蔗糖 ,0 3mol·L- 1NaCl,5 0mmol·L- 1NaH2 PO4 /Na4 P2 O7,10 0mmol·L- 1Tris HCl,pH7 4 )悬浮。取此悬浮液经蔗糖梯度离心 ,2 5 410 0×g ,70min。收集位于 0 6∶0 2 5mol·L- 1蔗糖界面间的部分 ,再 16 2 6 0 0×g离心 4 0min。所得沉淀即为心肌肌浆膜 ,用缓冲液D (0 2 5mol·L- 1蔗糖 ,30mmol·L- 1组氨酸 ,pH 7 4 )重悬。按文献方法测定标志酶Na+,K+ ATPase、Ca2 + ATPase和Azide敏感的Ca2 +,Mg2 +
ATPase活性<12 ,13> 。1 2 4 <12 5I> ghrelin受体结合测定 按文献<14 > 方法略做改进 ,将心肌肌浆膜 (80 μg蛋白 )加入到含0 0 5～ 3 0nmol·L- 112 5I ghrelin的反应缓冲液 (5 0mmol·L- 1Tris HCl,pH 7 3,2mmol·L- 1EGTA ,0 1%BSA ,0 0 3%杆菌素 )中 ,终体积 5 0 0 μl。同时测定含有和不含有 10 μmol·L- 1ghrelin的反应分别为非特异结合和总结合 ,37℃孵育 30min后 ,Mil lipore上经 0 4 5 μm滤膜真空泵负压抽滤 ,反应缓冲液冲洗 3次后 ,放入Wizard 14 70型γ计数仪测定放射性强度。由总结合与非特异结合的差值计算特异性结合 ,以fmol/mg蛋白表示。计算每个样本的结合位点数目 (最大结合能力 )及解离常数 (Kd)。1 3 统计学分析 实验结果以 x±s表示 ,多组资料采用one wayANOVA方法 ,组间用Student New man keuls法进行统计学处理。2 结果2 1 Ghrelin灌流对I/R心脏功能的影响 在缺血前 (以预灌流处理 ) ,各组间心率、心室内压及冠脉流量差异均无显著性 (结果未显示 )。灌流结束时 ,I/R组的心脏与对照组比较 ,心脏功能明显抑制 ,表现为冠脉流量减少 ,心率降低 ,LVSP及 + / -LVdp/dtmax降低 ,而LVDP增加 (均P <0 0 1)。缺血后心脏用 1× 10 - 10 ～ 1× 10 - 8mol·L- 1ghrelin再灌注时 ,心脏功能明显改善。与单纯I/R组比较 ,ghrelin呈浓度依赖性地增加冠脉流量 ,加快心率 ,升高LVSP及 + /-LVdp/dtmax(均P <0 0 1)、降低LVDP值 (P <0 0 1)。结果见Tab 1和 2所示。2 2 Ghrelin对冠脉流出液LDH活性、肌红蛋白含量和心肌组织MDA及ATP含量的影响 I/R使心肌代谢功能严重受损。I/R组冠脉流出液中LDH活性及Mb含量分别比对照组增加11倍和 5 8倍 (均P <0 0 1) ,心肌MDA含量增加 7倍 ,而心肌ATP含量则减少约 4 5 % (均P <0 0 1)。用ghrelin再灌注 ,明显减少缺血后的心肌LDH及Mb漏出量 ,亦呈浓度依赖性地增加了心肌组织ATP含量 ,并减少其MDA生成 (均P <0 0 1)。结果见Tab 1 EffectsofghrelinonHRandCPFonisolatedratischemia/perfusionhearts ( x±s,n =6)Group HR/beats·min- 1CPF/ml·g- 1 HW·min- 1Control 2 36± 2 0 10 8± 1 6I/R 14 8± 18##5 2± 1 2 ##I/R +Ghrelin 1× 10 - 1 0 mol·L- 1 172± 14 7 2± 1 4 I/R +Ghrelin 1× 10 - 9mol·L- 1 178± 18 7 8± 1 8 I/R +Ghrelin 1× 10 - 8mol·L- 1 191± 18 9 4± 1 0 HRandCPFvalueswere (2 42± 2 2 )beats·min- 1 and (10± 1)ml·g- 1 HW·min- 1 beforeischemiaincontrolgroup ,respectively ,andtherewasnosignificantdifferenceamonggroups (P >0 0 5 ) HR :heartrate ;CPF :coronaryperfusionflow ;HW :heartweight P <0 0 5vsI/Rgroup ; P<0 0 1vsI/Rgroup ;##P <0 0 1vscontrolgroupTab 3。2 3 12 5I His9 ghrelin受体结合测定 本实验以哇巴因敏感的Na+,K+ ATPase为心肌肌浆膜的标志酶 ,以Ca2 + ATPase为肌浆网标志酶 ,Az
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