黄柏为常用皮类中药 ,具清热 ,燥湿 ,泻火 ,解毒等功效 ,始载于《神农本草经》 ,列为上品<1> ,其后历代本草均有记载<2～ 3 > 。《中国药典》196 3～ 2 0 0 0年版均有收载<4> 。根据《中国药典》 ,黄柏的原植物有两种 ,即 :
关黄柏 (原植物为黄檗PhellodendronamurenseRupr)。
川黄柏 (原植物为黄皮树PhellodendronchineseSchneid .) ,其后证明川黄柏的原植物尚有秃叶黄皮树 (PhellodendronchineseSchneidvar.glabriusculumSchneid .)。药效学研究证明 :黄柏具有明显的抗菌消炎及降压作用 ,前者与其含有小檗碱有关 ,降压作用则与黄柏碱 (phellodendrine)有关。由于黄柏碱是黄柏的有效成分之一 ,建立其含量测定方法应有一定意义。1 实验部分1.1 实验材料川黄柏 :由四川彭县等地采集或国内药材公司、药市购买计 15件 ;由四川省中药研究所中药室苏光明研究员鉴定 ;关黄柏 :由辽宁、吉林、河北等省采集及国内药材公司、药市购买计 9件 ,由四川省中药研究所钟廷瑜副研究员鉴定。1.2 仪器与试药美国惠普公司HP110 0型高效液相色谱仪及HP 110 0可变波长检测器 ,ChemStation工作站、手动进样器、C18色谱柱 (Phenomenex ,15 0mm× 4 .6mm ,5 μ) ,溶剂 :均为色谱纯 (Fisher公司出品 ) ;试剂 :均为分析纯。黄柏碱对照品 :由本实验室分离 ,经MS谱 ,1H谱 ,13 C谱 ,DEPT谱 ,和HMBC谱并参照文献值鉴定 ,HPLC归一化法及薄层色谱法检查 ,纯度在 99%以上。1.3 样品的制备1.3.1 样品的提取 取黄柏药材粉末约 0 .5 g ,精密称定 ,加 1%醋酸———甲醇溶液 80mL ,水浴回流 1h ,滤过 ,用少量溶剂洗涤药材残渣及滤器 ,合并滤液及洗液 ,放冷 ,通过 10 g中性氧化铝柱 (10cm× 1.5cm) ,加 1%醋酸 甲醇溶液 5 0mL洗脱 ,合并流出液及洗脱液 ,浓缩至干 ,残渣加甲醇至 10mL使溶解 ,通过 0 .4 5 μm的微孔滤膜过滤 ,作为供试品溶液。1.3.2 对照品溶液的制备 精密称取黄柏碱适量 ,加 1%醋酸 甲醇溶液制成 0 .14 5 6mg·mL-1溶液 ,作为对照品溶液。1.4 色谱条件的选择及系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶作为填充剂 :乙腈 (0 .0 5mol·L-1磷酸水溶液 2 5 0mL +二乙胺 0 .4mL) ,(9∶91)为流动相 ;检测波长为 2 84nm ,流速 1.2mL·min-1柱温 2 5℃ ,理论板数按黄柏碱峰计算 ,应不低于 16 0 0。1.5 含量测定方法学考察1.5 .1 线性关系考察 精密吸取对照品溶液 3,6 ,9,12 ,15 μL ,注入高效液相色谱仪 ,以乙腈 (0 .0 5mol·L-1磷酸水溶液 2 5 0mL +二乙胺 0 .4mL) ,(9∶91)为流动相 ,用前述色谱条件测定峰面积 ,黄柏碱浓度为横坐标 (X) ,峰面积为纵批标 (Y) ,进行回归处理 ,回归方程 :Y =7.1780 +918.1776X ,r =0 .9998,说明线性关系良好 ,线性范围 :0 .4 36 8～2 .184 0 μg·μL-1。1.5 .2 进样精密度试验 精密吸取黄柏碱对照品溶液 ,重复进样 5次 ,每次 8μL ,测得黄柏碱峰面积峰的RSD =1.2 % ,说明本方法具有良好的精密度。1.5 .3 稳定性试验 分别于 0 ,1,2 ,4 ,6 ,8,2 4 ,4 8h ,精密吸取供试品溶液 5 μL ,注入高效液相色谱仪 ,测得的黄柏碱峰面积RSD =0 .85 % ,结果表明供试液在 4 8h内是稳定的。1.5 .4 重复性试验 精密称取同一批黄柏药材样品 5份 ,每份约 0 .5 g ,按供试品溶液制备方法及色谱条件进行黄柏碱含量测定 ,RSD =1.75 % ,可见本方法有良好的重复性。1.5 .5 回收率测定 采用加样回收法测定回收率。取川黄柏 5份 (HPLC法测定含量为 0 .4 84 % ) ,每份约 0 .2 5g ,精密加入浓度为 0 .14 97mg·mL-1的对照品溶液 3,6 ,9,12 ,15mL按 1.3.1项下操作 ,每份样品进样 5 μL ,照HPLC条件进行含量测定 ,计算 ,平均回收率为 10 1.4 3% ,RSD =1.5 6 % ,结果见表 1。表 1 黄柏碱回收率测定No 称样量(μg)加样量(μg)实测量(μg)回收率(% )平均值(% )RSD(% )10 .5 64 60 .2 2 460 .792 0 10 1.2 52 0 .5 893 0 .44 911.0 40 410 0 .453 0 .60 5 3 0 .673 71.2 91910 1.92 10 1.43 1.5 64 0 .610 3 0 .8982 1.5 41710 3 .835 0 .60 941.12 2 81.72 8799.691.6 药材样品中黄柏碱的含量测定2 4个黄柏药材样品 ,由四川省中药研究所中药研究室收集并鉴定 ,按上述方法进行黄柏碱的含量测定 ,结果见表2 ,表 3。表 2 川黄柏药材样品中黄柏碱含量测定 (n =3)样品号No 样品来源 黄柏碱(% )RSD(% )黄柏碱平均含量 (% )1四川彭州 0 .483 61.892四川内江药材公司 0 .2 85 61.613成都五块石药材市场 0 .40 2 2 0 .444四川荥经县药材公司 0 .3 942 1.155重庆涪陵药材公司 0 .3 95 11.2 56重庆南川县药材公司 0 .414 60 .647四川荥经县泾河水域 0 .5 90 70 .690 .42 108重庆石柱县药材公司 0 .48181.489四川达川药材公司 0 .45 70 0 .8210四川峨嵋县药材公司 0 .462 40 .7311四川雅安县 0 .5 840 1.9712四川乐山犍为县岷东乡 0 .47180 .4613四川洪雅县 0 .415 3 0 .8214四川青川县药材经营部 0 .2 9161.9615四川宜宾市药材公司 0 .18481.18表 3 关黄柏中黄柏碱含量测定 (n =3)样品号No 样品来源 黄柏碱(% )RSD(% )黄柏碱平均含量 (% )16辽宁伊通县药材公司 0 .14 62 1.8917吉林敦化市药材公司 0 .0 992 1.3 818吉林和龙市 0 .1860 1.8219吉林朝阳 0 .0 3 2 5 1.952 0吉林梅河口市 0 .0 92 5 0 .83 0 .14 682 1吉林安图市白河口镇 0 .2 0 3 3 1.952 2辽宁清源县药材公司 0 .2 0 44 1.972 3吉林双阳县 0 .15 5 11.732 4吉林通化市 0 .2 0 180 .3 9 结果可见 :川黄柏中黄柏碱的含量平均比关黄柏中高出3倍之多 ,而两种黄柏药材中黄柏碱的含量又因产地不同而有较大的差异。2 讨论2 .1 样品前处理方法的比较 根据初步试验 ,用HPLC法黄柏碱对照品HPLC图谱黄柏样品HPLC图谱测定药材中黄柏碱含量 ,药材需经预处理。其中优选最佳提取条件及氧化铝柱层析中洗脱剂的用量 ,是提取及洗脱完全的保证。为此 ,以回流时间、回流次数、溶剂量为影响药材中提取黄柏碱的 3因素 ,每因素 2水平 ,以提取液中黄柏碱的含量为评价标准 ,用L4(2 3 )正交表进行试验 ,结果证明以80mL 1%醋酸—甲醇回流提取 1h为最佳提取条件。对提取液用氧化铝柱除杂质洗脱溶剂用量进行比较的结果 ,证明用 5 0mL 1%醋酸—甲醇作为洗脱液 ,洗脱的黄柏碱占总黄柏碱的 99.7%以上。2 .2 由上述表 2、表 3可见 :川黄柏中黄柏碱的含量平均比关黄柏中高出 3倍之多 ,而两种黄柏药材中黄柏碱的含量又因产地不同而有较大的差异 ,由此提示在处方用药或以黄柏为制药原料时 ,应考虑黄柏的品种和产地 ,以保证药品的安全、质量和疗效。HPLC法测定黄柏中黄柏碱的含量@周德庆$四川省中药研究所!四川成都610041
@郭志雄$四川省中医药研究院附属医院!四川成都610041
@罗泽渊$四川省中药研究所!四川成都610041
@张爱军$四川省中药研究所!四川成都610041
@黄志芳$四川省中药研究所!四川成都610041川黄柏;;关黄柏;;
含量测定;;HPLC 目的:用反相高效色谱法测定川黄柏及关黄柏中黄柏碱的含量.方法:色谱条件:C18类型硅胶柱,乙腈-(0 .0 5mol·L-1磷酸水溶液2 5 0mL +二乙胺0 .4mL) ,(9∶91)为流动相,检测波长2 84nm .结果:黄柏碱平均回收率为10 1.4 3% ,RSD=1.5 6 % (n =5 ) ,线性范围0 .4 36 8～2 .184 0 μg·μL-1,r =0 .9998。结论:方法准确,操作较为简便易行,精密度及重复性良好,可用于黄柏药材中黄柏碱的含量测定。<1> 吴 普等述,孙星衍等辑.神农本草经
.人民卫生出版社,1982,43.
<2> 李时珍.本草纲目.人民卫生出版社,1977,3.
<3> 唐慎微.重修政和经史证类备用本草.人民卫生出版社,1957,299.