土槿乙酸 ( pseudolaric acid B,PAB)是松科植物金钱松树皮 (土槿皮 )中提取的有效成分。近年来研究发现 PAB具有较强的抗肿瘤作用 ,对K5 62 ,MCF- 7,MGC- 80 3,HT1 0 80等肿瘤细胞株有抑制作用 <1,2 > ,而对人黑素瘤细胞 ( Li Br)的作用研究尚未见报道。我们以 Li Br细胞株为靶细胞观察了不同浓度的 PAB在体外对该细胞增殖的影响及细胞形态变化 ,并对其抗肿瘤作用机制进行研究。1 材料与方法1 .1 材料与仪器 :PAB(含量 98% ,武警医学院药学教研室提供 ) ,DMEM培养基 ( Gibco公司产品 ) ,MTT、Hoechst33342、PI(碘化丙啶 )、胰蛋白酶 (均为 Sigma公司产品 ) ,Li Br(由天津市肿瘤医院生化室引进 ) ,胎牛血清 (中国医学科学院血液学研究所提供 ) ,青霉素、链霉素 (华北制药厂生产 )。5 5 0型全自动酶标仪 (美国 BIORAD)。1 .2 方法1 .2 .1 细胞培养 :Li Br细胞株体外培养于 DMEM培养基中 ,培养基内含 1 0 %胎牛血清、2 mmol/L谷氨酰胺、1 0 0 U/m L 青霉素、1 0 0 μg/m L 链霉素 ,置 37℃ ,5 % CO2 孵育箱中进行体外培养。1 .2 .2 细胞生长曲线的测定 :取对数生长期 Li Br细胞 ,用 0 .1 2 5 %胰酶和 EDTA液消化细胞 ,制成细胞混悬液 ,计数、调整细胞浓度为 3.0× 1 0 5/m L,接种于 2 5 m L 培养瓶内培养 2 4 h后 ,实验组加入不同浓度的 PAB( 5 ,1 0 ,5 0 μmol/L) ,对照组加等量培养基。以后每天随机从 4组细胞中 ,各取出 3瓶细胞 ,用台盼蓝拒染法 ,在光镜下计活细胞数 ,取平均值 ,以时间为横坐标 ,活细胞数为纵坐标 ,作图得细胞生长曲线。1 .2 .3 细胞形态学观察 :于加药后不同时间 ,在倒置显微镜下 ,观察细胞形态变化 ,并摄像记录。1 .2 .4 PAB对 Li Br的细胞毒作用 :按上述方法制成细胞悬液 ,调整细胞浓度为 4× 1 0 4/m L,接种于96孔培养板上 ,每孔加 2 0 0μL细胞悬液 ,培养 2 4 h后 ,加入不同浓度 PAB ( 3.1 2 5× 1 0 -6～ 1× 1 0 -4mol/L) ,倍比梯度稀释 ,另设对照组 (不加 PAB)和空白对照组 (只加培养基 )。每组设 8个复孔 ,加药后 48h,加 MTT( 5 mg/m L) 2 0 μL,4h后 ,加入DMSO2 0 0 μL 避光振荡 1 0 min,用全自动酶标仪(波长 490 nm)测定各孔吸光度 ( A)值 ,按文献 <3 >方法计算细胞生长抑制率。1 .2 .5 双荧光染色法检测细胞凋亡 :取对数生长期细胞加入不同浓度的 PAB ( 5× 1 0 -5,1× 1 0 -5,5× 1 0 -6mol/L )进行实验 ,于 2 4 ,48,72 h取出细胞 ,按文献 <4>方法 ,将细胞消化、离心、洗涤后制成细胞悬液 ,用Hoechest33342和 PI进行双荧光染色 ,在荧光显微镜下观察细胞核形态变化 ,并计数和摄像记录。1 .2 .6 PAB对 Li Br细胞 p2 1 WAF1表达的影响 :取对数生长期的细胞 ,加入不同浓度的 PAB ( 5×1 0 -5,1× 1 0 -5,5× 1 0 -6mol/L)继续培养 2 4 h,并设对照组 ,将细胞消化、离心、洗涤后涂片 ,用丙酮固定 ,免疫细胞化学染色步骤按博士德公司试剂盒说明书进行。1 .2 .7 统计学处理 :实验结果用统计软件 SPSS分析 ,组间进行 t检验。2 结果2 .1 PAB对 Li Br细胞生长的抑制作用 :由细胞计数绘制的生长曲线可见 ,Li Br细胞经 3种不同浓度的 PAB处理后 ,细胞生长受到明显的抑制 ,其中PAB 5 0μmol/L组的抑制作用最强 ,见图 1。1-对照 2 -PAB 5μmol/L 3 -PAB 10μmol/L 4-PAB 5 0μmol/L1-control 2 -PAB5 μmol/L 3 -PAB10 μmol/L 4-PAB5 0 μmol/L图 1 PAB对 L i Br细胞生长的抑制作用Fig.1 Inhibitory effect of PAB on growen of L i Br cells2 .2 PAB对 Li Br细胞形态变化的影响 :实验组细胞在加药后 2 4 h,在倒置光学显微镜下观察 ,可见大部分细胞由梭形变为圆形 ,胞体皱缩 ,细胞核边移 ,核凝集 ,细胞周围出现大小不等的膜被小体 ,尤以 PAB5 0 μmol/L组细胞形态变化最明显 ,细胞数与对照组比较明显减少。2 .3 PAB对 Li Br的细胞毒作用 :Li Br细胞经PAB处理 48h后 ,经 MTT法检测 ,活细胞数明显减少 ,IC50 值为 2 .5× 1 0 -5mol/L,与对照组有显著性差异 ,见表 1。2 .4 PAB诱发 Li Br细胞凋亡 :经双荧光染色法染色后 ,可见对照组细胞核均匀一致 ,被 Hoechest33342染成蓝色荧光 ,经 PAB处理后 ,核染色质凝集、碎裂、出现凋亡小体 ,凋亡细胞数目随药物浓度增加及用药时间延长逐渐增多 ,其中 PAB 5× 1 0 -5mol/L作用最为明显 ,于加药后 2 4 h细胞凋亡比率表 1 PAB对 L i Br的细胞毒作用Table 1 Cytotoxic effect of PAB on L i Br cells组别药物浓度 /(mol· L- 1 ) A4 90 抑制率 /%空白 -0 .0 890± 0 .0 0 5 80对照 -0 .464 0± 0 .0 2 5 7 0PAB 3 .12 5× 10 - 6 0 .3 75 8± 0 .0 2 95 * 2 3 .5 26.2 5 0× 10 - 6 0 .3 0 5 2± 0 .0 2 76* * 42 .3 51.2 5 0× 10 - 50 .2 92 2± 0 .0 2 3 6* * 45 .822 .5 0 0× 10 - 50 .2 70 2± 0 .0 2 49* * 5 1.695 .0 0 0× 10 - 50 .2 3 43± 0 .0 14 5 * * 61.2 51.0 0 0× 10 - 40 .1893± 0 .0 0 65 * * 73 .2 5 与对照组比较 :* P<0 .0 5 * * P<0 .0 1 * P<0 .0 5 * * P<0 .0 1vs control group可达 5 0 %以上 ,加药后 48h 细胞凋亡比率可达80 %以上。2 .5 PAB增强 Li Br细胞 p2 1 WAF1的表达 :经免疫细胞化学染色后 ,在光学显微镜下可见 p2 1 WAF1表达阳性产物位于细胞核和细胞浆中 ,其中核周区染色较深 ,其余区域则较浅。实验组经 PAB处理后可见阳性颗粒在细胞核区明显增强 ,以 5× 1 0 -5mol/LPAB处理后作用最为明显。在放大 2 0 0倍的视野下计数 1 0 0 0个细胞 ,计算阳性细胞占总细胞的比率 ,每种处理取 4个标本的均值 ,阳性细胞百分率由( 4 .1 3± 1 .0 8) %升高至 ( 4 3.1 8± 4.35 ) % ,有显著性差异 ( P<0 .0 1 ,n=4)。3 讨论 实验结果表明 ,PAB能有效地抑制 Li Br细胞的体外增殖 ,并能诱导其凋亡。 5 0 μmol/L PAB处理 Li Br细胞 2 4 h后 ,活细胞数较对照组减少达66% ,48h达 89% ,并随时间延长对细胞的抑制率也增加 ,细胞生长曲线测定及 MTT细胞毒实验检测均证明 PAB对细胞有明显抑制作用 ,其抑制率与药物浓度呈剂量依赖关系。细胞形态观察与双荧光染色法观察证明 ,PAB可诱导 Li Br细胞凋亡 ,使细胞核染色质凝集、边移、并发生碎裂、出现凋亡小体 ,而且还观察到凋亡细胞的比例与药物浓度及作用时间呈正相关。通过免疫细胞化学染色方法检测 Li-Br细胞内的 p2 1 WAF1基因表达 ,其表达明显增强 ,表明 PAB能阻止 Li Br细胞进入 S期 ,抑制细胞增殖 ,初步阐明了 PAB抑制肿瘤细胞生长的作用机制。细胞凋亡是正常细胞发育过程中细胞清除的正常途径 ,许多研究表明 ,肿瘤的发生与细胞凋亡的调节紊乱密切相关 <5>。凋亡发生时有凋亡小体形成 ,并被巨噬细胞吞噬 ,因此不会引起炎症反应 ,因此采用外源性药物诱导肿瘤细胞凋亡是一种非常理想的方法。本实验证明 PAB在抑制人黑素瘤细胞增殖的同时使细胞趋于凋亡 ,但作用机制尚不十分清楚 ,PAB作为细胞外信号分子 ,作用于细胞后 ,其受体和信号转导的过程 ,以及如何启动细胞凋亡基因表达值得进一步研究。土槿乙酸对人黑素瘤细胞增殖抑制作用研究@姜孟臣$武警医学院药学教研室!天津300162
@陈虹$武警医学院药学教研室!天津300162
@张敏$武警医学院药学教研室!天津300162
@陈莉$武警医学院药学教研室!天津300162土槿乙酸;;LiBr细胞;;细胞增殖目的 研究土槿乙酸(PAB)对人黑素瘤细胞(L i Br)生长的抑制效应,并探讨其作用机制。方法 用不同浓度的PAB加入体外培养L i Br细胞中,观察加药后细胞生长数量及其形态的变化;用MT
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