海马是脑内参与记忆贮存功能的重要部分 ,而海马CA3 区是学习记忆的关键部位 ,并对衰老较为易感。近年来 ,海马在老化过程中的形态学变化已在学术界受到广泛的关注 ,且用于老年性痴呆的形态学研究。我们在既往养寿丹能改善Alzheimer病肾阳虚模型大鼠学习记忆力 ,提高大鼠海马、额叶去甲肾上腺素 (NE)、多巴胺 (DA)、五羟色胺 (5 HT)含量研究的基础上〔1,2〕,运用老年性痴呆 (AD)病 证结合模型 ,观察养寿丹对大鼠海马CA3 区超微结构的影响。1 材料与方法1 1 实验动物 15月龄早老SD大鼠 40只 ,雌雄各半 ,由广东省卫生厅实验动物中心提供 ,动物合格证号码 :99A0 3 2。1 2 药物、试剂与主要仪器 养寿丹浸膏粉 (主要成分含巴戟天、肉苁蓉、熟地黄、何首乌、当归、白术、茯苓、远志、石菖蒲等中药 ,每克浸膏粉含生药 10g ,由广州兴华制药厂提供 ,批号9912 0 6)。脑复康购自东北制药厂 (批号 :9910 0 6)。D 半乳糖为上海试剂二厂产品 (批号 :960 92 6) ;醋酸氢化可的松购自浙江医药股分有限公司 (批号 :9910 15 ) ;鹅膏蕈氨酸 (IbotenicacidIBO ,Sigma公司 ) ,均为分析纯。AO 型超薄切片机 ,奥地利产 ;JEM 12 0 0EX型透射式电镜 ,日本产。1 3 痴呆模型的建立 根据文献〔3～ 6〕方法改进。1 3 1 老年肾虚证模型的建立 从实验的 1～ 40d ,对造模组大鼠每天行腹腔注射D 半乳糖 5 0mg/kg一次 ,造成亚急性衰老 ;然后用醋酸氢化可的松混悬液 15mg/kg在大鼠后腿肌肉发达处注射 10d ,每天一次 ,停药 10d ,造成肾阳虚。假手术组按上述操作分别注射等量生理盐水1 3 2 Alzheimer型痴呆模型的建立 从第 61天起 ,对造模大鼠行脑内双侧Meynert核 (参照大鼠脑立体定位图谱 ,定位坐标为AP 0 8mm ,ML 2 6mm ,DV 8 2mm)。脑内Meynert核注射时 ,大鼠先经 3 %的戊巴比妥钠 (3 0mg/kg)经腹腔麻醉后 ,将其固定在立体定位仪上 ,头顶部正中切口 ,暴露前囟 ,精确定位 ,用微量注射器将生理盐水溶解的IBO ,每侧注射 1μl(含IBO 5μg/μl)缓慢注入Meynert核 ,注射时间每侧持续 5min ,留针 10min。假手术组按上述操作注射等量生理盐水。1 3 3 实验分组给药 将存活动物随机分成老年性痴呆组 (B组 8只 )、
脑复康 (7g/kg)对照组 (C组 8只 )、
养寿丹 9g/kg组 (D组 8只 )、假手术组 (A组 8只 )并开始给药 ,连续灌胃 2个月。1 4 电镜标本制备 动物分四批处死 ,每批、每组随机选取 2只。先将大鼠按体重注射 3 %的戊巴比妥钠 (3 0mg/kg)经腹腔麻醉后 ,再注射肝素防止凝血 (每 10U肝素可抗凝 10 0ml血液 )。灌注固定 :将大鼠固定于解剖台上 ,暴露胸腔 ,从左心室把塑料插管插至主动脉处 ,用细丝线结扎固定牢靠 ,切开右心房。通过调整吊瓶高度来控制灌注压 ,先用生理盐水快速冲洗血管直至流出液体不见血色为止 ,灌注压维持在约 160 /10 0mmHg左右 (灌注速度为 10ml/min)。随后注入 4℃前固定液40 0ml ,灌注速度为 8ml/min ,灌注压维持在约 13 0 /90mmHg左右。灌注完毕后 ,立即断头取脑 ,在显微镜下 ,参照大鼠脑图谱〔6〕分离切取海马CA3 区 (如图 1)组织块 ,切成 (0 5～ 1 0 )mm3 的小块后 ,移入装有前固定液的标本瓶内做前固定 ,加盖做标记 ,放入 4℃冰箱 ,固定 2h后 ;4℃下用配制固定液的同系列缓冲液反复洗涤 3h(中间换液数次 )。经常规脱水、Epon812包埋 ,LKB超薄切片 ,醛酸铀、柠檬酸铅双重染色 ,JEM 12 0 0EX型透射式电镜观察并拍片。2 结 果2 1 脂褐质的变化 镜下可见假手术组海马神经元脂褐质数量较少 ,模型组脂褐质数量明显增多 ,且电子密度增高。养寿丹给药组脂褐质数量介于二者之间 ,有些电子密度降低 ;脑复康组较模型组减少 ,但仍明显多于养寿丹组 ,有些电子密度仍较高。2 2 线粒体的改变 与假手术组相比 ,模型组神经元内正常线粒体几乎不存在 ,大部分都变性坏死。线粒体呈肿大 ,嵴的双层膜结构不清、断裂、萎缩 ,重者出现突泡化。养寿丹组神经元内正常线粒体明显多于模型组 ,有明显的线粒体修复现象 ,变性坏死的线粒体数目明显少于模型组 ;脑复康组也呈现出变性坏死线粒体的修复 ,脱颗粒现象较模型组减轻。2 3 高尔基复合体及粗面内质网的改变 模型组尚可见高尔基复合体粗面内质网扩张 ,呈代偿增生性改变 ,这些改变在养寿丹、脑复康组已很少见。2 4 突触的改变 镜下可见模型组突触间隙模糊不清 ,突触连接间断 ,突触小泡大小不等 ,有些突触小泡聚集于突触前膜。养寿丹组及脑复康组均可见突触变性改变 ,但前者突触间隙相对清楚 ,突触连接相对完好 ,突触小泡较均匀 ,没有聚集于突触前膜现象 ,但与假手术组相比 ,仍有一定程度的变性。2 5 其他改变 模型组神经胶质细胞内可见多量富含脂滴的泡沫状结构 ,细胞核变形、双层膜结构消失 ,而在假手术组细胞核呈圆形 ,双层膜结构完整 ;养寿丹组则基本恢复正常 ,脑复康组仍见未修复的残存结构。图 1 养寿丹对AD肾阳虚大鼠海马CA3 区超微结构的影响3 讨 论海马与学习记忆密切相关 ,海马老化导致记忆减退。AD的病理学研究提示患AD时脑内出现的神经纤维缠结、老年斑及颗粒 空泡样变等在海马较其他脑区更为明显。本研究发现老年肾虚AD鼠在亚细胞水平的变化主要表现为脂褐质数量异常增多,神经元核膜内陷形成皱褶 ,核内出现空泡 ,神经元胞浆内线粒体数目减少 ,形态不规则 ,嵴变短 ,部分嵴缺失和线粒体内絮状斑块。主要细胞器如高尔基体、粗面内质网有明显的变形、增宽、脱颗粒等。有报告称大鼠海马CA3 区神经元细胞体内线粒体密度随增龄而减少〔7〕,与本研究结果相一致。海马及皮质神经细胞内内质网稀疏 ,高尔基体增多 ,呈空泡状 ,核糖体脱失 ,胞浆内脂褐质增多以及神经纤维髓鞘膜解离是本研究所发现的老年肾虚AD大鼠海马亚微结构的又一组病变特征。养寿丹组AD鼠脑海马CA3 区表现为脑神经细胞内脂褐质数目减少 ,核糖体脱失现象基本消失 ,高尔基体等重要细胞器有不同程度的修复 ,血管周围空腔样间隙消失等形态学变化 ,可能是养寿丹有抑制脑内脂褐质的形成和积累、促进脑细胞蛋白质的合成和改善脑部血液循环作用。神经元内线粒体数目增多 ,线粒体嵴无肿胀及变性 ,推测养寿丹能增强脑的能量代谢 ,提高神经细胞活力 ,延缓脑的老化 ,从而激发和提高脑的智能作用。本研究未进行脑组织的光镜观察 ,对于可能存在的的神经元纤维缠结及老年斑 ,还有待于进一步实验观察证实。养寿丹对Alzheimer病肾阳虚模型大鼠海马CA_3区超微结构的影响@刘明平$广州中医药大学中药学院!广东广州510405
@黄兆胜$广州中医药大学中药学院!广东广州510405
@孙维广$广州星群药业股份有限公司
@萱垣昇$日本第一药产株式会社!医生物学研究养寿丹;;
Alzheimer病;;
肾阳虚证; ;超微结构目的 从形态学角度探讨养寿丹对Alzheimer病老年肾阳虚模型大鼠脑组织的 修复作用。方法 应用电镜观察养寿丹对痴呆大鼠海马CA3区形态学变化。结果 模型组出现脂 褐质数量异常增多,神经元核膜内陷形成皱褶,核内出现空泡,神经元胞浆内线粒体数目减少,形 态不规则,嵴变短,部分嵴缺失和线粒体内絮状斑块。养寿丹能不同程度的修复和逆转上述病理改 变。结论 养寿丹对Azlheimer病老年肾阳虚模型大鼠脑组织有一定的修复作用。1 黄 兆胜,孙维广,刘明平,等养寿丹对阿尔茨海默病肾阳虚模型大鼠学习记忆的影响〔J〕中成药,2002;24(2):113115
2 黄兆胜,刘明平,孙维广,等养寿丹对阿尔茨海默病肾阳虚大鼠脑神经递质的影响〔J〕中国实验方剂学杂志,2002;8(1):2628
3 陈可冀,李春生新编抗衰老中药学〔M〕北京:人民卫生出版社,1998:153162
4 ConnorDJ ,LanglaisOJ,LeonJ Behavioralimpairmentsafterlesionsofthenucleu sbasalisbyibotenicacidandquisqualicacid〔J〕BrainRes,1991;555:84
5 秦路平,张家庆,石汉平,等蛇床子香豆素对肾阳虚模型大鼠腺垂体肾上腺皮质轴功能的影响〔J〕中国中西医结合杂志,1997;17(4):228
6 王宇平大鼠中枢神经系统解剖学基础〔M〕北京:人民卫生出版社,1986:152270
7 刘永海,吴丽娟,苗鸿才大鼠海马神经元及线粒体增龄性改变的形态计量分析〔J〕中华老年医 学杂志,1998;17(3):139神经纤维缠结、老年斑及颗粒空泡样变等在海马较其他脑区更为明显。本研究发现老年肾虚AD鼠在亚细胞水平的变化主要表现为脂褐质数量异常增多,神经元核膜内陷形成皱褶 ,核内出现空泡 ,神经元胞浆内线粒体数目减少 ,形态不规则 ,嵴变短 ,部分嵴缺失和线粒体内絮状斑块。主要细胞器如高尔基体、粗面内质网有明显的变形、增宽、脱颗粒等。有报告称大鼠海马CA3 区神经元
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