溶菌酶又称胞壁质酶或N 乙酰胞壁质聚糖水解酶 ,广泛存在于生物组织内 ,是一种无毒蛋白质。作为一类重要的酶制剂 ,溶菌酶能选择性地分解微生物的细胞壁形成溶菌现象 ,同时不破坏其他营养成分而具有杀菌、抗病毒、抗肿瘤细胞等功效 ,在食品工业、医疗、生物学领域有着广泛的用途<1～ 5> 。在过去 ,生物工程和食品加工业用的溶菌酶都是从蛋清中分离获得 ,仅能够溶解革兰阳性菌。来自海洋微生物代谢产物的新型溶菌酶具有嗜低温、抗氧化及溶菌谱广的特点 ,能特异性地分解革兰阴性、阳性菌的细胞壁 ,具有杀菌、防腐、抗病毒等功效 ,在医药、食品工业及生物高新技术产业等领域有独特优势和广阔的市场前景<6 > 。为了进一步确定其毒性 ,给今后的合理应用提供理论依据 ,本文以小鼠为受试动物 ,对海洋低温溶菌酶进行了毒理学研究 ,并对其安全性进行评价。现将结果报告如下。1 材料和方法1.1 试验材料海洋低温溶菌酶 ,由中国水产科学院黄海水产研究所提供 ;昆明种小鼠 ,由河南医科大学试验动物中心提供 (合格证号码 :4 10 117)。1.2 小鼠急性毒性试验试验用小鼠均在标准室温 (2 4℃ )和湿度(6 0 % )条件下饲养 7d后进行试验。1.2 .1 最大耐受量的测定 取昆明种小鼠 2 0只 ,体质量 18～ 2 2g ,雌雄各半 ,禁食 12h ,经灌胃一次给予 2 6 0g/L(为海洋低温溶菌酶的最大溶解度 )低温溶菌酶 ,灌胃容量均为每只 0 .8mL ,用药后连续观察 14d内小鼠的活动状态、饮食情况、粪便、呼吸、体质量及死亡情况。 14d后禁食 12h ,脱臼处死小鼠 ,进行尸检 ,观察各主要脏器的变化。1.2 .2 LD50 的测定<7> 经预试验 ,得到海洋低温溶菌酶尾静脉给药 10 0 %估计致死量 (Dm)及 0的估计致死量 (Dn)分别为 6 40 0 .0 0和 3377.4 8mg/kg体质量。取健康昆明种小鼠 70只 ,体质量 18～ 2 2g ,随机分为 7组 ,每组 10只 ,雌雄各半。在Dm与Dn间按 1.0 0∶0 .88的比值分为 6个不同剂量 ,分别为6 40 0 .0 0、5 6 32 .0 0、4 95 6 .16、4 36 1.4 2、3838.0 5和 3377.4 8mg/kg体质量 ,一次性尾静脉注射给药 ,给药量每只 0 .8mL ,对照组给予同等容量的生理盐水。给药后连续观察 7d ,记录小鼠的反应并计算各组动物的死亡率 ,7d后未死动物全部处死 ,采用孙式改良Karber法计算海洋低温溶菌酶一次性尾静脉注射小鼠LD50 :LD50 =log- 1
。式中Xm 为最大反应率组剂量的对数 ,i为组间剂量比的对数 ,∑P为各组反应率的和。并观察各主要脏器的情况。2 结 果2 .1 小鼠最大耐受量测定结果2 0只小鼠经灌胃给药后未出现明显毒性反应 ,连续观察 14d无死亡者。计算得到海洋低温溶菌酶的最大耐受量为 10 4 0 0 .0 0mg/kg体质量。将动物处死后 ,肉眼观察心、肺、肝、食管、胃、小肠、小脑、大脑、肾上腺、甲状腺、肾、脾、胸腺、子宫、卵巢、输卵管、睾丸、输精管、附睾、前列腺等均无异常现象。2 .2 小鼠LD50 的测定结果各组小鼠尾静脉给药后死亡率为 10 0 %、90 %、5 0 %、5 0 %、30 %和 0 ,死亡发生在给药后 2 4h内 ,其中绝大多数于用药后 2～ 5min内即死亡 ,死前有挣扎、呼吸抑制、四肢无力及大小便失禁 ,死后解剖肉眼观察及脏器镜检结果与对照组相比无异常发现。LD50 为 4 5 30 .5 4mg/kg体质量 ,LD50 的 95 %可信限为4 193.19～ 4 86 7.89mg/kg体质量 ,LD50 的 99%可信限为 4 0 88.2 4～ 4 972 .84mg/kg体质量。3 讨 论2 0世纪 70年代以来 ,海洋生物酶研究引起学术界和酶制剂工业的高度重视 ,对低温海洋生物酶的研究已逐渐成为发达国家开发新型酶制剂的重要途径<8,9> 。由于海洋特殊的低温环境 ,海洋生物所产生的具有特殊性能的酶 ,在低温条件下与相应的陆生动、植物产生的酶相比有相对高的活力。溶菌酶最大的用途是作为食品防腐剂 ,所以确定海洋低温溶菌酶经口一次性给药所产生的毒性反应及LD50有重要意义。急性毒性试验是对动物一次性给药后出现的毒性反应所进行的定性和定量试验 ,是对化合物安全性评价的第一步 ,和其他毒性试验相比 ,具有简单、经济、易行等特点。本试验小鼠灌胃的LD50 因受海洋低温溶菌酶溶解度的限制无法测定 ,因此通过小鼠尾静脉给药来测定其LD50 。结果显示 ,海洋低温溶菌酶的LD50 为 4 5 30 .5 4mg/kg体质量 ,LD50 的95 %可信限为 4 193.19～ 4 86 7.89mg/kg体质量 ,LD50 的 99%可信限为 4 0 88.2 4～ 4 972 .84mg/kg体质量。预试验未能测出海洋低温溶菌酶在最大质量浓度 2 6 0g/L和小鼠最大允许灌胃量的半数致死量(LD50 ) ,故求其最大耐受量值<10 > 。本文结果显示 ,海洋低温溶菌酶对小鼠灌胃的最大耐受量为10 4 0 0mg/kg体质量 ,按WHO 1977年颁布化学物质急性毒性分级标准 ,尤其是我国对职业性化学毒物危害程度的分级标准———中华人民共和国国家标准(GB5 0 4 4- 85 ) ,灌胃小鼠半数致死量 (LD50 ) >5 0 0 0mg/kg体质量 ,为实际无毒物。由此 ,确定海洋低温溶菌酶为实际无毒物。海洋低温溶菌酶为典型的低温酶 ,最适作用温度范围 5～ 5 0℃ ,在 5℃仍保持了 5 5 %的酶活力 ,且广谱杀菌、低毒 ,作为具有我国独立知识产权的食品防腐剂 ,对民族工业的发展具有重要意义海洋低温溶菌酶的急性毒性试验@郭沈波$青岛大学医学院药理学教研室!山东青岛266021
@郭坤$青岛大学医学院实验室管理科
@杨志宏$青岛大学医学院药理学教研室!山东青岛266021
@刘玉爱$青岛大学医学院附属医院药剂科
@刘占涛$青岛大学医学院药理学教研室!山东青岛266021
@仲伟珍$青岛大学医学院药理学教研室!山东青岛266021
@王跃军$中国水产科学研究院黄海水产研究所
@王春波$青岛大学医学院药理学教研室!山东青岛266021胞壁质酶;;急性毒性试验;;小 鼠①目的 对海洋杆菌产低温溶菌酶进行安全性评价。②方法 应用小鼠急性毒性试验,观察海洋 低温溶菌酶对小鼠一次灌胃后和尾静脉注射后所产生的急性毒性反应。③结果 小鼠一次灌胃的最大耐受量为104 0 0 .0 0mg/kg体质量;小鼠一次尾静脉注射的LD50 为4 5 30 .5 4mg/kg体质量,LD50 的95 %可信限为4 193.19～4 86 7.89mg/kg体质量,LD50 的99%可信限为4 0 88.2 4～4 972 .84mg/kg体质量。④结论 海洋低温溶菌酶为实际无毒物<1>张宗岩.溶菌酶及其应用.食品科学,1995,16(9):59.
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@郭坤$青岛大学医学院实验室管理科
@杨志宏$青岛大学医学院药理学
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