大量研究表明 ,许多中药成分在治疗心血管疾病中具有显著疗效 ,能减轻各种致病因素对血管内皮细胞的损伤作用<1> ,但对葛根素对血管内皮细胞的保护作用研究甚少。目前 ,葛根素注射液是临床上治疗心脑血管疾病的有效药物之一。它具有扩张冠状动脉和脑血管 ,降低心肌耗氧和血液粘滞度的作用。近几年又发现还有降血糖和降血脂的功能。本实验主要是通过体外羟自由基条件培养人脐静脉内皮细胞 (ＨＵＶＥＣｓ) ,同时使用中药葛根素 (Ｐｕｅｒ ａｒｉｎ)进行干预 ,观察葛根素能否减轻羟自由基对内皮细胞功能的损害作用 ,进一步探讨葛根素在心血管疾病中的作用机理。1 材料与方法1.1 主要试剂与仪器葛根素注射液 (广东燕塘生物化学药业有限公司 ) ;16 40培养粉、胶原酶和胰蛋白酶 (上海生化研究所 ) ;ＮＯ试剂盒 (南京建成生物工程研究所 )和ＡＣＥ试剂盒 (北京海军总医院 ) ;ＣＯ2细胞培养箱(美国 ) ;ＹＪ 130 0医用超净工作台 (苏州净化设备公司 ) ;倒置显微镜 (日本 ) ;2 2 8ｎｍ的紫外分光光度和5 5 0ｎｍ的分光光度计 (上海光学仪器制造厂 )。1.2 细胞培养采用改良的Ｊａｆｆｅ<2 > 法 ,在无菌条件下取健康产妇正常分娩胎儿脐带 2 5～ 30ｃｍ ,用Ｈａｎｋｓ液冲洗干净 ,再灌入 0 .1%的Ⅰ型胶原酶在 37℃温箱中培养 18～ 2 0ｍｉｎ。然后放出消化后的胶原酶 ,并用含2 0 %小牛血清的ＲＰＭＩ - 16 40液冲洗脐静脉二次 ,一起到集到培养皿中 ;将消化液移入两根试管内 ,以10 0 0转的速度离心 10ｍｉｎ ,弃上清液 ,用手指轻弹试管底部数次 ,再加入含 5 %ＣＯ2 小牛血清的ＲＰ ＭＩ 16 40培养液制成细胞悬液 ,收集至培养瓶中 ,放入 37℃含 5 %ＣＯ2 的卵箱中培养 ,2 4ｈ换液 ,待细胞长成融合状态 ,进行形态学鉴定 ,确定为内皮细胞后再进行传代培养 ,用第 3～ 5代生长良好的ＨＵ ＶＥＣｓ进行实验。1.3 实验分组根据羟自由基的有无分成两组 ,每组又分为空白、葛根素Ⅰ (0 .5ｍｇ/ｍｌ)和葛根素Ⅱ (1.0ｍｇ/ｍｌ)三小组 ,每小组 8个培养孔。1.4 实验条件的设计1) 羟自由基来源 :根据文献方法<3> ,羟自由基由亚铁离子催化过氧化氢即Ｆｅｎｔｏｎ反应发生。实验时选择 10 - 6 ｍｏｌ/Ｌ的ＯＨ- 1为实验浓度。把外源性ＯＨ- 加入到培养液中进行细胞培养。2 ) ＨＵＶＥＣｓ的体外羟自由基培养 :取生长良好的第 3～ 5代ＨＵＶＥＣｓ制成细胞悬液 ,在常温37℃、大气压条件下含 5 %的ＣＯ2 细胞培养箱中 ,按1× 10 5的细胞密度接种 1.0ｍｌ于 2 4孔细胞培养板 ,每组 8孔 ,以含 10 %的新生小牛血清的ＲＰＭＩ 16 40营养液进行培养 ,待细胞生长成亚融合状态(约 2 4ｈ) ,弃去原培养液 ,换成无小牛血清的ＲＰ ＭＩ 16 40营养液 ,追加外源性ＯＨ- 使终浓度为 10 - 6ｍｏｌ/Ｌ ,同时按终浓度为 (1)空白对照 ;(2 )葛根素Ⅰ(0 .5ｍｇ/ｍｌ) ;(3)葛根素Ⅱ (ｍｇ/ｍｌ)分别追加葛根素 ,并继续培养 4 8ｈ。3) ＨＵＶＥＣｓ无羟自由基的体外培养 :取同样的细胞悬液 ,在常温 37℃、大气压条件下含 5 %的ＣＯ2 细胞培养箱中 ,按 1× 10 5的细胞密度接种 1.0ｍｌ于 2 4孔细胞培养液 ,每组 8孔 ,以含 10 %的新生小牛血清的ＲＰＭＩ 16 40营养液进行培养 ,待细胞生长成融合状态 (约 2 4小时 ) ,弃去原培养液 ,换成无小牛血清的ＲＰＭＩ 16 40营养液 ,同时按终浓度为(1)空白对照 ;(2 )葛根素Ⅰ (0 .5ｍｇ/ｍｌ) ;(3)葛根素Ⅱ (1.0ｍｇ/ｍｌ)分别追加葛根素 ,并继续培养 4 8ｈ。1.5 观察指标及检测方法1) ＮＯ浓度的测定 :用一氧化氮试剂盒 (酶法 ) ,根据ＮＯ化学性质活泼 ,在体内代谢很快转为ＮＯ2 - 、ＮＯ3- ,ＮＯ2 - 进一步转化为ＮＯ3- ,本法用硝酸还原酶特异性将ＮＯ3- 还原为ＮＯ2 - ,通过显色深浅在 5 5 0ｎｍ浓度 0 .5光径 ,测样品吸收值。通过 :ＮＯ(μｍｏｌ/Ｌ) =(样品管吸收光度 空白管吸光度 ) /(标准管吸光度 空白管吸光度 )× 10 0×样品稀释倍数公式算出待测样品的ＮＯ浓度。2 ) 上清液ＡＣＥ活性的测定 :利用马尿酰甘氨酸在ＡＣＥ的作用下水解成马尿酸及甘氨酰甘氨酸 ,用乙酸乙酯提取马尿酸 ,蒸干 ,溶于氯化钠液 ,紫外2 2 8ｎｍ测定马尿酸量。根据各管的ＯＤ值 ,通过公式 :(测定 -空白 )ＯＤ× 3马尿酸 με× 0 .88× 0 .15× 0 .5 / 1.5× 6 0计算出ＡＣＥ的含量。1.6 数据统计所有的数据均以ｘ±ｓ表示 ,均数之间差别检验以ｔ检验分析 ,Ｐ <0 .0 5有统计学意义。2 实验结果本实验无羟自由基培养的三个组中 ,葛根素Ⅰ和Ⅱ与对照组相比 ,虽然ＶＥＣｓ产生ＮＯ的量增加 ,分泌ＡＣＥ的活性下降 ,但差别不大 ,没有显著意义。羟自由基培养组中的对照组与无羟自由基的对照组相比 ,ＶＥＣｓ产生ＮＯ的量显著减少 ,ＡＣＥ的活性则明显增加 ,差别均有显著意义 (Ｐ <0 .0 1) ;加用葛根素干预后 ,ＶＥＣｓ分泌ＮＯ的量有所增加 ,而ＡＣＥ的活性则降低 ,与对照组相比 ,葛根素Ⅰ的差别有统计学意义 (Ｐ <0 .0 5 ) ,葛根素Ⅱ的差别则更大 ,有显著意义 (Ｐ <0 .0 1)。具体结果见附表 :附表 羟和无羟自由基培养时ＶＥＣｓ分泌ＮＯ的量及ＡＣＥ活性的影响 (ｘ±ｓ ,ｎ =8)组别 药物浓度(ｍｇ/ｍｌ) ＮＯ(μｍｏｌ/Ｌ) ＡＣＥ(Ｕ/ｍｌ)无羟自由基组对照组 80 .93± 5 .92 2 3 .3 6± 2 .88葛根素Ⅰ 0 .5 85 .12± 5 .2 62 1.2 4± 2 .5 0葛根素Ⅱ 1.0 86.5 4± 6.42 2 0 .75± 2 .10 ^羟自由基组对照组 67.2 1± 4.2 8 2 8.17± 3 .0 2 葛根素Ⅰ 0 .5 75 .2 5± 6.3 0 △ 2 4.3 0± 2 .80 △葛根素Ⅱ 1.0 78.89± 5 .14 △△ 2 2 .0 1± 3 .2 1△△ 与无羟自由基对照组比较 Ｐ <0 .0 1,与羟自由基中对照组比较△Ｐ <0 .0 5 ,△△Ｐ <0 .0 13 讨论3.1 羟自由基培养对ＶＥＣｓ分泌功能的影响目前大量研究认为 ,冠心病、高血压和脑血管硬化等疾病的发生与自由基损伤均有密切关系 ,其中羟自由基作用最强。Ｐｈｏｈｌ和Ｏｈａｒａ等<4 > 研究发现氧化型ＬＤＬ能与内皮细胞膜结合生成过多的脂质过氧化物 ,从而降低了内皮细胞ＮＯＳ(一氧化氮合酶 )的活性 ,使ＮＯ产生下降。Ｈｏｌｌａｎｄ等<5,6 > 把培养的ＨＵＶＥＣｓ直接暴露在 1× 10 - 6 ｍｏｌ/Ｌ的Ｈ2 Ｏ2中 4ｈ ,结果发现内皮细胞结构和功能的变化与ＨＵＶＥＣｓ在高浓度ＬＤＬ中培养所发生的变化相类似。可能主要是因为羟自由基有较强的化学活性 ,除了本身可造成生物大分子的损伤 ,还能与细胞膜的不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应 (ＬＰＯ)破坏细胞膜的结构 ,从而改变了细胞内某些酶的活性和受体功能 ,导致细胞内ＮＯＳ活性降低 ,使ＮＯ产生减少。我们在实验中观察了外源性羟自由基对体外培养ＨＵＶＥＣｓ功能的影响以及葛根素对其干预作用。结果发现外源性羟自由基使培养的内皮细胞产生ＮＯ明显减少 ,而产生ＡＣＥ却显著增多。3.2 葛根素对体外羟自由基条件培养ＨＵＶＥＣ的干预作用葛根素系中草药葛根的提取物 ,其有效成份为异黄酮甙。早在 2 0世纪 6 0年代就陆续有学者对葛根素的药理作用进行了研究 ,认为葛根素主要是具有扩张冠状动脉和脑血管 ,降低心肌耗氧量 ,改善心肌收缩功能 ,并能降低高血压病人中的血浆儿茶酚胺含量 ,以及降低血小板聚集及血液粘滞度的作用。另有研究表明<7> ,它还能减轻脂质过氧化对内皮细胞的损害 ,减少丙二醛 (ＭＤＡ)和凝血烷 (ＴＸＡ2 )的分泌 ,维护内皮细胞膜结构的稳定。邝枣园<8> 等研究发现 ,葛根素对外源性羟自由基有明显的抑制作用 ,认为葛根中的黄酮可能是清降自由基的有效成份之一。李妮<9> 则认为葛根素就是一种良好的外源性氧自由基清除剂。在本实验中我们使用葛根素对体外羟自由基条件培养的ＨＵＶＥＣｓ进行了干预作用 ,结果也发现 ,用葛根素干预后其血管内皮细胞产生的ＮＯ明显增加 ,且随着剂量增加而增加 ,因此推测葛根素可能主要是通过抑制ＯＨ 对内皮细胞膜的氧化作用而发挥功效的 ,并随剂量的增加而作用更强。确切机理有待进一步研究葛根素对羟自由基培养HUVEC_s分泌NO和ACE活性的影响@肖礼祖$江西医学院心血管病研究所!江西南昌330006
@罗伟$江西医学院心血管病研究所!江西南昌330006
@苏海$江西医学院心血管病研究所!江西南昌330006
@程晓曙$江西医学院心血管病研究所!江西南昌330006
@吴清华$江西医学院心血管病研究所!江西南昌330006羟自由基;;血管内皮细胞;;一氧化氮;;血管紧张素转移酶;;葛根素目的 :采用羟自由基条件体外培养人脐静脉血管内皮细胞 (HUVECs) ,观察中药葛根素 (Puerarin)对内皮细胞产生一氧化氮 (NO)和血管紧张素转移酶 (ACE)活性的影响。方法 :利用胶原酶消化人脐静脉获得血管内皮细胞 (VE
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