青蒿素是在菊科植物黄花蒿和青蒿中发现的一种成分,为白色针状结晶。80年代,通过对青蒿素结 构的测定,确证其为含过氧桥的倍半萜内酯化合物。我教研室研究证明该药有明显的抗心律失常作用nJ,其机制主要为抑制内向整流K’电流＆’及k bJ。已有报道青蒿素对某些体外细胞系有抑制增值及杀伤细胞的能力H J,为了探讨青蒿素对HeLa细胞是否有作用,我们研究了它对体外培养的HeIJa细胞生长的影响。l材料与方法1.1药物与试剂 青蒿素由沈阳药科大学提供,用前以生理盐水稀释成所需浓度,MTr(四甲基偶氮唑盐)为Sig ma公司产品,用无血清的RMPll640培养液稀释成5mg/rIll,阿霉素为FARMITALIA:ERBA公司生产。l。2仪器c()2孵育箱(日本三洋公司生产),倒置显微镜(日本生产),450型酶标仪(Bio.Rad生产)。1.3细胞及培养 HeIJa细胞由本教研室保存,用RMPll640(Hv.clone)含lO％新生牛血清( }tyclone),l％青霉素、1％链霉素中常规培养,每2。3天传一代。1.4台盼蓝染色试验将处于对数生长期的细胞接种于96孔板上,l×104个/孔,给不同浓度的药物处理3天后,计 算各组的细胞增殖抑制率。增殖抑制率=(1一实验组3天细胞数,对照组3天细胞数)×100％1.5MTI’测定 将处于对数生长期的细胞l×1矿个接种于96孔板上,每孔100出,c02孵育箱温育12h后 ,给青蒿素及阳性药阿霉素浓度分别为80pmol/I.、40/~mol/I。20pmol /I。、10grml/L.、5/anol/L,每孔50出,生理盐水组作阴性对照。药物作 用48h后,加MTr每孔20肚l,温育4h后弃上清,加DMSO每孔100m,振荡摇匀,在490nm酶标仪上读吸光值,计算抑制率,求IC50。细胞抑制率:(1一实验组吸光度值尉照组吸光度值)x 100％1.6电镜形态学观察 细胞经对照组、给药组作用48h后,收集细胞,常规固定、脱水、包埋、切片、染色,进行透射电镜观察。1.7细胞凋亡率检测 细胞经对照组、给药组作用48h后,收集2×106个细胞,70％乙醇固定,4℃过夜,PI染色,流式细胞仪检测。2结果2.1对细胞生长的影响 给药3天后高浓度组较低浓度组抑制细胞的作用增强,细胞增殖抑制率见表1。表l青蒿素对HeLa细胞增殖抑制率的影响 增殖抑制率(％)~(pmol。’’—_磊i———i森2.2青蒿素对细胞的直接杀伤作用 随浓度及时间的增加,药物对细胞的杀伤作用明显。用概率对数法分析其I‰为55.58pmol/I。,可信区间在52.77—58.76p.mol/L.之间,见表2。表2 blTr法测定青蒿素对HeLa细胞生长的影响 细胞破坏率(％)浓度(tool。。)—1磊r——丽2.3对细胞形态学的改变 正常的细胞圆形,表面有许多稀散的小绒毛和由脂膜形成的球状突起,线粒体嵴丰富,核体积较大, 核仁清晰,核分裂相较多,游离核蛋白体丰富(图1);给药组细胞表面无绒毛,细胞体积明显减 小,形态不一,胞质内可见较多的脂类脱失后残余的脂滴空泡(图2),内质网脱颗粒,线粒体空 泡变,核大,松散,核仁减小,核分裂相减小,游离核蛋白体减小,胞核成密集团块(核固缩),部分细胞本身裂成碎片,形成凋亡小体(图3)。2.4流式细胞仪检测结果见表3,从结果可见,青蒿素的浓度在20。80tamoEI。之间引起细胞的凋亡率在8％一3 0％之间,与浓度正相关,但没有阿霉素引起的细胞凋亡率高。表3青蒿素作用HeLa细胞后流式细胞仪对凋亡率的分析3讨论由实验结果可见,青蒿素对HeLa细胞的生长有抑制作用,且随浓度及时间的增加抑制作用增强, 对细胞的杀伤作用不如阿霉素。但已有报道,中药的IC∞<20/~g/ml,且呈剂量依赖性 .此药有杀伤作用L5】,所以青蒿素对细胞有杀伤作用。从电镜结果可见,青蒿素可诱导细胞凋 亡,表现典型的细胞凋亡特征(产生凋亡小体)。青蒿素是目前最有效且不易产生抗药性的一线抗 疟药,对肿瘤生长的抑制作用是近年来研究的新热点之一。已有报道青蒿素对艾氏腹水瘤【6’及 对55种肿瘤细胞系有一定的细胞毒作用口】,如果将其应用范围扩展到肿瘤细胞的化疗上应当有 重要的意义。尤其是它的细胞毒性非常低,作为化疗药其副作用较小,因此,进一步研究它作用的 量效关系有助于论证其应用于肿瘤治疗的可行性。癌细胞分裂时,需要大量铁质才能复制染色体, 故癌细胞的铁浓度较正常细胞高出许多。而当青蒿素与铁质混在一起时,就会产生化学作用,令青蒿素变成一种自由基(freeradical),将细胞杀死哺’。至于它的确切的作用机制,还需要进一步探讨。 (本文图l,图2,图3见封3页).青蒿素对体外培养的HeLa细胞生长的影响(正文见423页)图1未经药物作用的HeLa细胞 ×2 000图2青蒿素作用HeLa细胞48h后,胞质内可见脂滴空泡 ×10 000图3青蒿素作用Heh细胞48h后,形成凋亡小体 ×10 000青蒿素对体外培养的HeLa细胞生长的影响@董海鹰$哈尔滨医科大学药理学教研室!黑龙江哈尔滨150086
@宋维华$哈尔滨医科大学药理学教研室!黑龙江哈尔滨150086
@孙建平$哈尔滨医科大学药理学教研室!黑龙江哈尔滨150086
@王玲$哈尔滨医科大学药理学教研室!黑龙江哈尔滨150086
@杨宝峰$哈尔滨医科大学药理学教研室!黑龙江哈尔滨150086
青蒿素;;
HeLa细胞;;
透射电镜 目的研究青蒿素对体外培养的HeLa细胞生长的抑制作用。方法 用台盼蓝染色观察药物对细胞的增殖抑制率;MTT法测定药物的抗肿瘤活性;透射电镜观察药物对肿瘤细胞形态学的影响;流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果 台盼蓝染色法证实青蒿素对HeLa细胞有抑制作用,抑制率与药物浓度正相关;细胞经药物作用4 8h后的IC50为55.58μmol/L;电镜观察细胞有典型的凋亡形态特征(凋亡小体) ;流式细胞仪检测细胞凋亡率在一定范围内与药物浓度正相关。结论青蒿素可抑制HeLa细胞的生长,诱导HeLa细胞凋亡。<1>王惠珍,杨宝峰,罗大力,等.青蒿素抗心律失常作用的研究
.中国药理学通报,1998． 14(1) :94．
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