海洋贝类提取物 (Extract of Seashells,ESs)是从 3种常见养殖贝类牡蛎、贻贝及扇贝中经一定方法提取出来的有效成分 ,其中含有丰富的牛磺酸、多不饱和脂肪酸、糖胺聚糖等 ,作者已有实验证明其具有抗动脉粥样硬化 (Atherosclerosis AS)作用 ,且与其调节脂质代谢紊乱作用密切相关 (见另文 )。现已知血管平滑肌细胞(Vascular smooth muscle cells,VSMCs)是 AS形成过程中最为重要的细胞之一 ,其由中膜向内膜下迁移并异常增殖是 AS发生的病理基础 ,在 AS的病理形成过程中具有重要作用。因此作者采用 2 0 %胎牛血清 (Fetalbovine serum,FBS)、碱性成纤维细胞生长因子 (Basic fibroblast growth factor,b FGF)所诱导的大鼠 VSMCs增殖模型来探讨 ESs是否具有抑制 VSMCs增殖作用 ,以期为 ESs抗 AS作用机制提供理论依据。1 材料和方法1.1 药品和试剂海洋贝类提取物 (ESs) :青岛大学医学院药理教研室提供 ,浓度为 2 g/ ml(生药 ) ;肝素 (Heparin) :上海生化制药厂 (批号 0 0 0 32 5 ) ;碱性成纤维细胞生长因子 (b FGF) :珠海东大生物制药有限公司 (批号 990 6 0 1) ;M199干粉 :GIBCO公司产品 ;胎牛血清 (FBS) :中国浙江省轻工业研究所制造 (批号 0 0 0 312 ) ;乙二胺四乙酸二钠(EDTA) :济南鲁康化学工业有限公司 ;胰蛋白酶、TYPE- 胶原酶 :Sigma公司产品 ;结晶紫 :天津市佳惠天新精细化工开发中心 (批号 990 4 2 0 ) ;2 ,5 -二甲基 -四溴盐 (MTT) :美国 AMRESCO公司产品。1.2 实验动物和仪器雄性 Wistar大鼠 3只 ,体重 15 0～ 2 0 0 g,由青岛大学医学院动物管理科提供 ;超净工作台 :济南 JHT;CO2孵育箱 :Heto Denmark;倒置相差显微镜 :日本 Olympus;酶联免疫检测仪 :华东电子管厂。1.3 血管平滑肌细胞培养用胶原酶消化法进行原代培养 ,第 3天即见贴壁的细胞已伸展 ,呈“峰 -谷”交错状生长 ,用平滑肌 α- actin免疫荧光鉴定为 VSMCs,待长成致密单层时即用等量的 0 .12 5 %胰蛋白酶及 0 .0 2 % EDTA混合液进行传代培养。实验用 5～ 8代细胞。1.4 ESs对 2 0 % FBS介导的 VSMCs增殖的影响1.4 .1 细胞计数法取 5～ 8代细胞 ,以 1× 10 4细胞 /孔接种于 96孔板 ,将细胞分为正常组、模型组、ESs组 (2 5、5 0、10 0μl/ ml)及肝素组 (10 0 μg/ ml) ,每组 8孔 ,2 4 h后换成含 0 .4 % FBS的 M199培养液 ,继续培养 4 8h后除正常组外其他组均换成含 2 0 % FBS的 M199培养液 ,同时给药组分别加入相应浓度的药物 ,继续孵育 4 8h后终止培养 ,用细胞计数板进行计数。1.4 .2 结晶紫染色法细胞接种入 96孔板 ,经 0 .4 % FBS的 M199培养液孵育及实验分组、给药孵育均同上。当终止培养后 ,吸出原液 ,加入 1%戊二醛固定 15 min,再加入 0 .1%结晶紫染色 30 min,用去离子水荡洗 15 min,自然晾干 ,在倒置相差显微镜下观察细胞形态及数目 ,并照相。然后每孔加入 0 .2 % Triton X- 10 0 10 0 μl,使细胞内结晶紫溶解 ,在酶联免疫测定仪上于 5 95 nm波长处比色进行吸光度 (A)测定。1.4 .3 MTT比色法细胞接种入 96孔板 ,经 0 .4 % FBS的 M199培养液孵育及实验分组、给药孵育均同上。当换成含 2 0 %FBS的 M199培养液加入药物继续孵育 4 4h后 ,吸出原液 ,每孔加入 5 mg/ ml MTT2 0 μl,孵育 4 h,吸出液体 ,加入 DMSO 2 0 0μl/孔 ,溶解结晶 ,在酶联免疫测定仪上于 5 70 nm及 6 30 nm波长处比色 ,测其吸光度 (A)。1.5 ESs对 b FGF介导的 VSMCs增殖的影响细胞接种入 96孔板及实验分组同上 ,当孔中培养液换成含 0 .4 % FBS的 M199培养液培养 4 8h后 ,除正常组外其他组均加入 5 0 ng/ ml b FGF,同时给药组分别加入相应浓度的药物 ,继续培养。并按上述同样方法分别进行细胞计数、结晶紫染色及 MTT比色。1.6 统计学处理本实验中所有数据均采用 x± s表示 ,组间均数的比较用 t检验。2 结果2 .1 ESs对 2 0 % FBS介导的 VSMCs增殖的影响与正常组比较 ,2 0 % FBS所致的模型组 VSMCs数目明显增多 ,吸光度值显著增大 (P<0 .0 1) ,而 ESs组(2 5、5 0、10 0 μl/ ml)以及肝素组的细胞生长明显受抑制 (P<0 .0 1) ,见表 1。结晶紫染色图像亦显示 ESs各剂量组细胞数量显著减少 (见图 1) ,而且随着浓度增高 ,对细胞的抑制作用越大。表 1 ESs对 2 0 % FBS介导的 VSMCs增殖的影响 (n=8,x±s)Table 1 Effects of the extract of seashells (ESs) on the proliferation of cultured rat vascularsmooth muscle cells (VSMCs) induced by 2 0 % FBS (n=8,x± s)组别 Group 细胞计数 (× 10 5)Cell count(× 10 5)结晶紫染色 (A)Crystal violetstain (A)MTT比色法 (A)MTT method (A)对照组 Control group模型组 Model groupESs2 5 μl/mlESs5 0 μl/mlESs 10 0μl/mlHeparin 10 0μg/ml5 .16± 1.0 99.86± 0 .89△△6.0 5± 0 .83 * *5 .43± 0 .68* *5 .0 9± 0 .82 * *5 .3 0± 1.0 6* *0 .0 83± 0 .0 0 90 .13 8± 0 .0 10 △△0 .10 3± 0 .0 13 * *0 .10 2± 0 .0 11* *0 .0 91± 0 .0 10 * *0 .0 94± 0 .0 13 * *0 .0 47± 0 .0 100 .0 87± 0 .0 12 △△0 .0 62± 0 .0 15 * *0 .0 60± 0 .0 18* *0 .0 5 5± 0 .0 10 * *0 .0 5 7± 0 .0 13 * * △P<0 .0 5 ,△△ P<0 .0 1 * P<0 .0 5 ,* * P<0 .0 1A B图 1 ESs对 2 0 % FBS介导的 VSMCs增殖的影响 (结晶紫染色× 10 0 )A:Model group B:ESs5 0 μl/ml groupFig.1 Effects of ESs on the proliferation of cultured rat VSMCsinduced by2 0 % FBS(n=8,Crystal violet stain× 10 0 )2 .2 ESs对 b FGF介导的 VSMCs增殖的影响如表 2所示 ,b FGF所引起的 VSMCs增殖模型建立 ,经 2 5、5 0、10 0μl/ ml ESs以及 10 0μg/ ml肝素孵育后的细胞生长明显被抑制 (P<0 .0 5、P<0 .0 1) ,图 2也显示给药组细胞数量显著减少 ,且浓度越大 ,对细胞的抑制作用越强。表 2 ESs对 b FGF介导的 VSMCs增殖的影响 (n=8,x± s)Table2 Effects of ESs on the proliferation of cultured rat VSMCs induced by b FGF(n=8,x±s)组别 Group 细胞计数 (× 10 5)Cell count(× 10 5)结晶紫染色 (A)Crystal violetstain(A)MTT比色法 (A)MTT method(A)对照组 Control group模型组 Model groupESs 2 5μl/ mlESs 5 0μl/ mlESs 10 0μl/ mlHeparin10 0 μg/ ml5 .13± 0 .879.73± 0 .65△△5 .90± 0 .71* *5 .2 3± 0 .80 * *4.88± 0 .74* *5 .10± 0 .60 * *0 .0 71± 0 .0 100 .14 0± 0 .0 13△△0 .0 96± 0 .0 0 9* *0 .0 89± 0 .0 17* *0 .0 86± 0 .0 18* *0 .0 91± 0 .0 12 * *0 .0 3 0± 0 .0 100 .0 77± 0 .0 13△△0 .0 47± 0 .0 0 9* *0 .0 45± 0 .0 15 * *0 .0 40± 0 .0 13 * *0 .0 45± 0 .0 11* * △ P<0 .0 5 ,△△P<0 .0 1 *P<0 .0 5
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