脑泰方是治疗缺血性中风的有效方剂 ,临床用于治疗气虚血瘀型脑梗死取得了较好效果<1,2 > 。本研究旨在从保护血管内皮细胞免受炎症介质损伤的角度初步探讨其提取物作用机理。1 材料与方法1.1 主要药品与试剂脑泰方提取物 (ＮＴＥ)脑泰方由川芎、地龙等药物组成 ,经水煎、醇提后制成浸膏粉 (由湖南中医学院药学分院制剂教研室提取 ,每 1ｇ浸膏粉含生药 4ｇ)。将其溶液经 0 .2 2 μｍ微孔滤膜加压过滤除菌后 ,分装冻存备用。ＲＰＭＩ 16 40培养基干粉 ;Ｇｉｂｃｏｌ产品 ;胎牛血清 :天津ＴＢＤ公司 ;胰蛋白酶 :美国Ａｍｉｅｓｃｏ产品 ,上海生物工程技术服务有限公司分装 ;重组人肿瘤坏死因子 (ｒｈＴＮＦ α) :ＰＥＰＲＯＴＥＣＨＥＣ公司产品 ,晶美公司提供 ;兔抗人Ⅷ因子相关抗原血清 :Ｓｉｇｍａ公司 ;ＤＡＢ显色试剂盒 :华美公司 ;ＳＡＢＣ(兔ＩｇＧ)免疫细胞化学试剂盒 :Ｂｏｓｔｅｒ公司 ;人酶标ｖＷ因子检测试剂盒 :苏州大学医学院血栓室。新鲜胎儿脐带 :由长沙市妇幼保健院产科提供。1.2 人脐静脉内皮细胞培养参照Ｊａｆｆｅ等建立的方法<3> ,生长汇合的内皮细胞在显微镜下呈椭圆形、多角形、梭形 ,成“铺路石”样紧密镶嵌排列。并经ⅧＦ∶Ａｇ免疫组化鉴定呈阳性反应 (附图 - 1) ,表明所培养的细胞为内皮细胞。1.3 实验方法将 2 4孔培养板中生长良好并已融合的人脐静脉内皮细胞随机分为 6组 :ＮＴＥ高、中、低剂量组 (终浓度 10 0ｎｇ/ｍｌ的ｒｈＴＮＦ α及生药终浓度 6ｍｇ/ｍｌ、2ｍｇ/ｍｌ和 0 .6 7ｍｇ/ｍｌ的ＮＴＥ混合 )、ＮＴＥ对照组 (仅加生药终浓度 2ｍｇ/ｍｌ的ＮＴＥ)、ＴＮＦ组 (仅加终浓度10 0ｎｇ/ｍｌ的ｒｈＴＮＦ α)及空白对照组 (仅加等量ＰＢＳ) ,每组 10孔。换液后 ,置 37℃、5 %ＣＯ2 环境中孵育 2 4ｈ后进行观察和指标检测。1.4 观察指标与检测方法1.4 .1 一般形态学观察 在普通倒置显微镜及倒置相差显微镜下观察内皮细胞的形态变化并摄相。1.4 .2 ＨＵＥＣ培养液ｖＷ因子含量测定 采用夹心酶联免疫吸附法测定 ,测试药盒由苏州大学医学院血栓室提供。1.5 统计学方法计量资料以“平均值±标准差”(ｘ±ｓ)表示 ,数据结果采用ＳＰＳＳ 10 .0统计软件包进行处理。多组样本均数间比较用Ｆ检验 ,两两之间比较用ｑ检验。计数资料用 χ2 检验。2 结果2 .1 ＨＵＥＣ一般形态学观察经ｒｈＴＮＦ α作用后细胞形态发生显著变化。相差显微镜及普通光镜下主要表现为较多细胞收缩成圆形固缩状 ,细胞间隙变宽 ,甚至发生脱落并出现异常颗粒 ;部分细胞纵轴拉长、横轴缩小 ,表现为成纤维细胞型外观 (附图 - 2、附图 - 3)。ＮＴＥ高、中剂量组仅见细胞拉长、细胞间隙略增宽 ,但细胞及核边界尚清楚、形态较规则 ;圆形固缩状细胞数目明显较ＴＮＦ组减少 (附图 - 4、附图 - 5 )。低剂量组细胞与ＴＮＦ组比较 ,细胞形态变化无明显差异。单独添加中剂量ＮＴＥ 2 4ｈ后细胞形态和生长状况与空白对照组无明显差异 (附图 - 6 )。2 .2 对培养液中ｖＷＦ含量的影响由表 1可见 ,ＴＮＦ组培养液中ｖＷＦ含量明显升高 (Ｐ <0 .0 1) ,而ＮＴＥ高、中剂量可抑制这种改变(Ｐ <0 .0 1和Ｐ <0 .0 5 ) ;低剂量的ＮＴＥ组ｖＷＦ含量有降低趋势 ,但无统计学意义 (Ｐ >0 .0 5 )。单独用ＮＴＥ对ｖＷＦ水平改变不明显 (Ｐ >0 .0 5 )。ＮＴＥ各剂量与ｖＷＦ含量存在较好的相关性 (ｒ =- 0 .85 3,Ｐ<0 .0 5 ) ,表明ＮＴＥ对ＨＵＥＣ分泌释放ｖＷＦ的作用1 .内皮细胞免疫组化鉴定 ,细胞呈阳性反应 ,胞浆深棕褐色 ,核仅着淡褐色 ,界限清楚 (2 5 0× ) ; 2 .ＴＮＦ组 ,添加 10 0ｎｇ/ｍｌｒｈＴＮＦ α后 ,ＨＵＥＣ收缩变圆 ,脱落 ,细胞数目减少 (10 0× ) ; 3 .ＴＮＦ组 ,深加 10 0ｎｇ/ｍｌｒｈＴＮＦ α后 ,ＨＵＥＣ形态收缩变圆 ,细胞内出现粗糙颗粒样变化 (2 5 0×相差 ) ; 4.ＮＴＥ高剂量组 ,ＨＵＥＣ受ｒｈＴＮＦ α刺激后 ,仅以外形拉长为主 ,可见部分细胞收缩变圆 ,其余正常 (10 0× ) ; 5 .ＮＴＥ中剂量组 ,ｒｈＴＮＦ α刺激后 ,ＨＵＥＣ脱落较少 ,细胞形态基本正常 (10 0× ) ; 6.ＮＴＥ对照组 ,单独添加脑泰方提取物后 ,ＨＵＥＣ生长正常 (10 0× )。附图 ＨＵＥＣ形态显微镜观察图具有剂量 效应关系。表 1 ＮＴＥ对ＴＮＦ α诱导ＨＵＥＣ损伤培养液中 ｖＷＦ含量的影响 组 别ｎｖＷＦ(% )空白对照组 10 6.3 4± 2 .66ＮＴＥ对照组 10 7.60± 1.10ＴＮＦ组 10 11.96± 2 .78 ＮＴＥ低剂量组 10 10 .86± 3 .11ＮＴＥ中剂量组 10 9.0 9± 1.93 #ＮＴＥ高剂量组 10 8.61± 3 .0 0 ## 注 :与空白对照组比较 Ｐ <0 .0 1;与ＴＮＦ组比较 #Ｐ <0 .0 5 ,##Ｐ <0 .0 1。3 讨论研究表明 ,ＴＮＦ α是一多向性的细胞因子 ,可诱导血管内皮细胞发生凋亡<4 > ;并可提高粘附分子的表达 ;升高毛细血管通透性 ,促使ＶＥＣ释放凝血第Ⅷ因子 ,从而启动凝血过程 ,造成局部组织血液供给中断和出血坏死 ,促进脑缺血及水肿的发生。因此 ,有研究认为ＴＮＦ α与ＶＥＣ参与的“缺血 炎症 血栓”过程在脑缺血损伤的病理过程中有着重要的地位<5> 。本研究结果显示 ,单独加入ｒｈＴＮＦ α后 6ｈ即可见细胞的正常外观发生改变 ,周边的部分细胞可见纵轴拉长 ,横轴缩小 ,与文献报道<6 > 相符 ;而 2 4ｈ后观察发现 ,多数细胞收缩变圆 ,或呈皱缩外观 ,甚至发生脱落 ,胞内显得粗糙有异常颗粒 ,此改变应为ＴＮＦ α用量较大所致 ;因为本实验所使用的ＴＮＦ α剂量较大 ,活性为终浓度 >2 0 0 0Ｕ/ｍｌ ,实验结果与金镇等的报告基本一致<7> 。而ＮＴＥ高剂量组、中剂量组光镜下也出现细胞形态改变 ,但未见明显细胞损伤和脱落 ,提示一定浓度的ＮＴＥ对ＴＮＦ引起的内皮细胞损伤具有保护作用。ｖＷＦ是血管内皮细胞分泌的活性物质之一 ,通常主要贮存在血管内皮细胞的Ｗｉｅｂｅｌ Ｐａｌａｄｅ小体内 ,呈连续、恒定的基础分泌。内皮细胞受刺激或损伤时发生排粒作用 ,ｖＷＦ释放增加 ,测定ｖＷＦ含量可作为ＶＥＣ受损的标志物<8> 。ｖＷＦ作为ＦⅧ载体 ,可使血浆中ＦⅧ保持稳定 ,促进血小板粘附。在本实验中 ,经ＴＮＦ α作用后的内皮细胞释放ｖＷＦ增加 ,而ＮＴＥ在高剂量和中剂量下 ,可显著降低培养液中ｖＷＦ的含量水平 ,说明ＮＴＥ对血管内皮细胞具有较好的保护作用。为了消除药物直接加入细胞培养体系所导致的非特异性反应 ,本实验设立了药物对照组。结果显示 ,药物对照组与空白对照组比较 ,细胞形态学改变和培养液中ｖＷＦ含量变化均无明显差异 ,且ＮＴＥ抗ＴＮＦ α所引起的ｖＷＦ含量变化具有剂量 效应关系 ,表明中药ＮＴＥ对ｒｈＴＮＦ α引起的ＨＵＥＣ损伤具有明显的对抗作用 ,保护血管内皮细胞免受炎症介质的损伤可能是脑泰方治疗缺血性中风的重要机制。脑泰方提取物抗 肿瘤坏死因子诱导人脐静脉内皮细胞损伤的研究@陈颂$湖南中医学院血管生物学实验室!湖南长沙410007
@葛金文$湖南中医学院血管生物学实验室!湖南长沙410007
@邓冰湘$湖南中医学院血管生物学实验室!湖南长沙410007脑泰方提取物;;肿瘤坏死因子;;血管内皮细胞;;血管性假血友病因子目的观察肿瘤坏死因子α(TNF α)对培养的人脐静脉内皮细胞的损伤作用及中药脑泰方提取物(NTE)的保护作用。方法将融合生长人脐静脉内皮细胞 (HUEC)随机分为空白对照组、TNF α组、NTE对照组和NTE高、中、低剂量组 ,观察 1 0 0ng/ml的TNF α作用 2 4h后内皮细胞显微形态的改变及培养液中血管性假血友病因子 (vWF)含量。结果TNF α作用后细胞形态发生显著变化 ,相差显微镜及普通光镜下主要表现为较多细胞收缩成圆形固缩状 ,细胞间隙变宽 ,甚至发生脱落并出现异常颗粒 ;部分细胞纵轴拉长 ,横轴缩小 ,表现为成纤维细胞型外观 ,培养液中vWF含量显著升高 (P <0 .0 1 ) ;NTE高剂量组、中剂量组细胞拉长 ,细胞间隙略增宽 ,但细胞及核边界尚清楚 ,形态较规则 ,与TNF组比较 ,圆形固缩状细胞数目减少 ,vWF含量明显降低 (P <0 .0 5 ,P <0 .0 1 ) ;单独添加中剂量NTE 2 4h后细胞形态和生长状况及vWF含量与空白对照组无明显差异 (P >0 .0 5 )。结论一定剂量的NTE对TNF α诱导的HUEC损伤有较好的保护作用。<1> 贺运河,郝晓元,葛金文,等.脑泰方治疗气虚血瘀型脑梗死临床研究
.中国中医急症,2001,10(6):319.
<2> 贺运河,葛金文,成战鹰,等.脑泰方对气虚血瘀型脑梗死患者血浆TXB2、6 ketoPGF1α及血清TNF α含量的影响.中国中医药信息杂志,2002,9(4):16.
<3> JaffeEA ,NachmanRL ,BecckerCG ,etal.Cultureofhu manendothelialcellsderivedfromumbilicalveins.JClinInvest
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