本室近年来对许多中药的抗凝作用进行了研究 ,发现僵蚕具有较强的抗凝作用。桑叶是家蚕的主要食物 ,系一味传统中药 ,具有疏风清热、清肝明目的作用。本室拟就桑叶对不同动物的体内外抗凝作用做了初步的研究 ,为进一步开发利用提供实验依据。1 材料与方法1.1 实验材料1 .1.1 桑叶提取液的制备 市售桑叶去尘渣后用蒸馏水浸泡 1ｈ ,煮沸 30ｍｉｎ绞取滤液 ,再加水于残渣并煮沸 ,合并二次滤液 ,离心去渣后加热浓缩至每毫升含生药 2ｇ ,加 95 %酒精至 6 0 %浓度 ,在 4℃过夜后 30 0 0ｒ/ｍｉｎ离心 ,取上清液 ,再加热去乙醇加水至含生药 2ｇ/ｍｌ,离心沉淀 ,取上清药液 ,ｐＨ 7.3,冷藏 ,供实验用。1.1.2 试剂 凝血酶、组织凝血活酶和部分凝血活酶按Ｄｅｎｓｏｎ方法<1> 制备 ;肝素为上海生物化学制药厂生产 ;按下述方法制备去抗凝血酶Ⅲ (ＡＴ Ⅲ )及去纤溶酶原兔血浆 :Ｋｏｉｄｅ和Ｄｅｕｔｓｃｈ等所述分别用肝素亲和层析和赖氨酸亲和层析制备兔ＡＴ Ⅲ和纤溶酶原。常规免疫羊制备抗血清 ,经硫酸铵沉淀 ,透析得抗兔ＡＴ Ⅲ及兔纤溶酶原免疫球蛋白。正常兔血浆与等量抗兔ＡＴ -Ⅲ或抗兔纤溶酶原免疫球蛋白混合 ,置冰箱过夜后离心取上清液即为去ＡＴ Ⅲ和纤溶酶原兔血浆。1.2 方法1.2 .1 对全血凝固时间的影响 取 18～ 2 0ｇＬＡＣＡ纯种小鼠 36只 ,按性别、体重随机分为 6组 ,即 5个不同剂量桑叶组与 1个盐水对照组 ,桑叶不同剂量组按每 2 0ｇ小鼠体重分别注入 5 0、10 0、2 0 0、4 0 0、5 0 0ｍｇ桑叶生药量计算 ,将桑叶液或盐水分别注入小鼠腹腔 (0 .5ｍｌ/2 0ｇ体重 ) ,注射后 2 0ｍｉｎ自眼眶后取血检验。1.2 .2 体外实验 取 1.5～ 2 .0ｋｇ健康家兔 ,两性兼有。家兔颈总动脉以塑料管放血 ,以 38ｇ/Ｌ浓度枸橼酸钠抗凝 ,经离心制备贫血小板血浆供检测下列指标 ①全血凝固时间 (ＣＴ) :采用挑丝法测定小鼠全血凝固时间 (ｍｉｎ)。②激活部分凝血酶时间(ＡＰＴＴ) :按 1∶5倍比法将不同稀释度药液加入贫血小板血浆中 ,然后按白陶土激活法测定激活部分凝血酶时间。③凝血酶原时间 (ＰＴ) :按 1∶5倍比法将不同稀释度药液加入贫血小板血浆中 ,然后按一期法测定凝血酶原时间。④凝血酶时间 (ＴＴ) :按 1∶5倍比法将不同稀释度药液加入贫血小板血浆中 ,然后再按直接法测定凝血酶时间。⑤桑叶液抗凝血酶活性对ＡＴ Ⅲ依赖性检查 :分别以去ＡＴ Ⅲ和去纤溶酶原兔血浆为前后血浆 ,加入桑叶液或肝素溶液 ,测定ＴＴ ,观察在有或无ＡＴ Ⅲ时桑叶液的抗凝血酶活性。1.2 .3 统计方法 结果采用均数±标准差 (ｘ±ｓ)表示 ,组间比较用ｔ检验。2 结果2 .1 对体内全血凝固时间的影响小鼠腹腔注射桑叶液后 ,2 0 0ｍｇ/2 0ｇ小鼠体重以上剂量 2 0ｍｉｎ全血凝固时间显著延长 (Ｐ <0 .0 5 ,Ｐ <0 .0 1) ,其延长程度与注入剂量呈明显剂量 效应依赖关系 ,表明桑叶在小鼠体内具有抗凝作用 ,见表 1。表 1 不同剂量的桑叶液对小鼠全血凝固时间的影响(ｎ =6,ｘ±ｓ)动物分组 剂 量(ｍｇ/2 0ｇ)凝血时间(ｍｉｎ)凝血时间比值(桑叶 /盐水 )生理盐水组 2 .11± 0 .3 1-桑叶 1组 5 0 2 .5 9± 0 .2 11.2 3桑叶 2组 10 0 2 .94± 0 .17 1.3 0桑叶 3组 2 0 0 3 .43± 0 .2 1 1.63桑叶 4组 40 0 3 .87± 0 .40 1.83桑叶 5组 5 0 0 4.2 1± 0 .3 2 2 .0 0注 :与生理盐水组比 Ｐ <0 .0 5 , Ｐ <0 .0 1。2 .2 体外凝血试验2 .2 .1 对实验家兔凝血时间的影响 由表 2可见 ,桑叶使家兔血浆ＫＰＴＴ、ＰＴ、ＴＴ显著延长 ,1∶12以下浓度与生理盐水组相比有显著性差异 (Ｐ <0 .0 1) ,且 3者均成明显的剂量 效应依赖关系 (ｒ =0 .981,0 .989,0 .981,Ｐ <0 .0 1)。同时可看出稀释度越小抗凝活性越强。表 2 不同稀释度桑叶对家兔凝血时间的影响(ｎ =6,ｘ±ｓ)药液最终稀释度 凝血时间 (ｓ)ＫＰＴＴＰＴＴＴ生理盐水 1∶3 3 6.2± 2 .3 14 .2± 0 .816.6± 1.2桑叶 1∶3 >3 0 0 >3 0 0 >3 0 0 1∶6182 .7± 11.6 12 2 .6± 8.8 87.3± 8.31∶12 12 0 .7± 8.1 5 9.9± 7.8 42 .9± 6.5 1∶2 45 1.3± 7.43 2 .0± 5 .0 2 3 .3± 2 .91∶483 7.0± 3 .814 .5± 1.2 19.2± 3 .2注 :与生理盐水组相比 Ｐ <0 .0 5 , Ｐ <0 .0 1。2 .2 .2 桑叶液抗凝血酶活性对ＡＴ Ⅲ的依赖关系由表 3可见 ,当用去纤溶酶原兔血浆作为基质血浆时 ,桑叶提取液与肝素均表现出抗凝血酶作用。但当用去ＡＴ Ⅲ兔血浆作为基质血浆时 ,肝素的抗凝血酶作用基本消失 ,证明肝素的抗凝作用需要ＡＴ Ⅲ参与 ,但桑叶提取液的抗凝作用十分明显 ,表现其活性不依赖ＡＴ Ⅲ的存在。2 .2 .3 酸碱对桑叶提取液抗凝活性的影响 分别调桑叶提取液的ｐＨ 5 .0或ｐＨ 9.0 ,放置 30ｍｉｎ后测得其抗凝活性无明显变化。说明其活性对酸碱有一定的耐受性。表 3 ＡＴ Ⅲ对桑叶提取液和肝素抗凝活性的影响(ｎ =5 ,ｘ±ｓ) 组 别去纤溶酶原血浆去ＡＴ -Ⅲ血浆Ｔｒｉｓ(缓冲液 ) 17.7± 0 .416.6± 0 .6桑叶 (5 0ｍｇ生药 /ｍｌ) 3 4.7± 0 .63 1.5± 1.6 肝素 (0 .2ｕ/ｍｌ) 43 .5± 2 .7 18.2± 1.5注 :采用Ｄｕｎｎｅｔ检验 ,与对照组相比 Ｐ <0 .0 1。3 讨论大量实验与临床资料表明 ,许多严重危害人类健康的疾病 ,如脑血栓、心肌梗死、弥漫性血管内凝血、肺栓塞、深部静脉血栓等的发生、发展与血栓形成密切相关。对于血栓形成的防治 ,必须从保护血管内皮、降低血小板功能、抑制血液凝固、促进纤溶活性、降低血液粘滞性、改善血流动力与流态条件等多个环节采取措施。在血栓形成的防治中 ,抗凝药物的应用是首要环节。因此 ,寻找具有抗凝作用的中药方剂或单味中药或有效成分 ,不仅对临床防治血栓形成具有实践意义 ,而且有益于活血化瘀治则的深入研究与进一步发展。桑叶提取液与肝素相比较 ,其抗凝血酶活性并不强 ,但对反应外源性凝血途径的ＰＴ和反映内源性凝血途径的ＫＰＴＴ ,二者的抗凝环节是有较大区别的。由于凝血因子Ｘａ是影响ＰＴ和ＫＰＴＴ的共同因素<3> ,故桑叶提取液除拮抗凝血酶外 ,还可能具有抗因子Ｘａ的作用。肝素也同样具有抗凝血酶和Ｘａ的作用。但我国市售肝素系一系列分子量不同的多糖的混和物 ,不同分子量肝素灭活因子Ｘａ和凝血能力是不同的。目前十分重视的低分子量肝素灭活因子Ｘａ与灭活凝血酶活性之比远高于普通肝素 ,这种高抗因子Ｘａ活性被认为是低分子量肝素抗血栓形成功能较强而造成出血倾向危险较小的机理之一。从抗凝作用的侧重环节来看 ,桑叶提取液的抗凝活性更接近于低分子量肝素。故也可能具有普通肝素不具有的优点 ,桑叶提取液的另一个与肝素不同之点是与ＡＴ Ⅲ的关系 ,肝素的凝血酶活性几乎全部依赖于ＡＴ Ⅲ的存在 ,这就限制了肝素的应用。在ＡＴ Ⅲ功能异常或含量低下的情况下 ,肝素的抗凝作用就会减弱。但从本实验结果看 ,无论ＡＴ Ⅲ是否存在于血浆 ,桑叶提取液均可抑制凝血酶水解转变为纤维蛋白的作用 ,表明其抗凝血酶活性具有不依赖于ＡＴ Ⅲ的性质。本实验制备的桑叶提取液工艺比较简单 ,但成分较复杂 ,目前要确定其抗凝活性来源于何种成分 ,尚待进一步深入研究。桑叶提取液对凝血机制的影响@彭延古$湖南中医学院血管生物学实验室!湖南长沙410007
@葛金文$湖南中医学院血管生物学实验室!湖南长沙410007
@付灿云$湖南中医学院血管生物学实验室!湖南长沙410007
@曾序求$湖南中医学院血管生物学实验室!湖南长沙410007桑叶;;抗凝成分;;凝血酶目的观察桑叶提取物对凝血机制的影响。方法小鼠腹腔注射桑叶提取物后测定全血凝固时间 ;在兔血浆中加入桑叶提取物后 ,测定激活的部分凝血酶时间 (APTT)、凝血酶原时间 (PT)和凝血酶时间(TT) ,在去抗凝血酶Ⅲ (AT Ⅲ )和去纤溶酶原兔血浆中加入桑叶提取物后测定TT。结果桑叶提取物能明显延长小鼠全血凝固时间和显著延长兔血浆的APTT、PT和TT ,显有明显的剂量 效应依赖关系 (P <0 .0 1 ) ,对去AT Ⅲ和去纤溶酶原血浆同样有显著的延长TT的作用 (P <0 .0 1 )。结论桑叶提取物具有明显的抗凝作用 ,其抗凝作用主要是通过抑制凝血酶水解纤维蛋白原转变为纤维蛋白而实现的<1> 李安国,彭延 古,葛金文,等.僵蚕提取液抗凝活性初步研究
.湖南中医学院学报,1992,12(3):37.
<2> 贺石林,彭延古,李安国,等.地龙提取液抗凝作用与毒性.湖南医科大学学报,1990,15(2):107.
<3> 葛金文,彭延古,邓常青,等.全蝎提取液抗凝作用及毒性实验的研究.中药药理与临床,1994,10(特刊):32.湖南省省
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