螺旋藻是一种微藻类古老生物 ,属于蓝藻门、蓝藻纲、颤藻目、颤藻科、螺旋藻属。目前进行大规模养殖的有钝顶螺旋藻和极大螺旋藻。钝顶螺旋藻多糖 (ＰＳＰ)是从钝顶螺旋藻中提取的一种水溶性多糖类化合物 ,为一种白色粉末状物质 ,对人体无毒 ,由于具有突出的生理活性 ,其生物药物的研究与开发成为目前海洋生物医药的重要研究领域之一<1,2 > 。目前国内外对ＰＳＰ的研究已有不少报道 ,多集中于抗衰老、降血脂、促进蛋白质合成、提高免疫功能、抗肿瘤、抗辐射的作用 ,而ＰＳＰ抗病毒作用研究 ,国内尚未见文献报道。充分利用国内的自然资源 ,进一步研究ＰＳＰ抗病毒作用的机制 ,将为螺旋藻类药物开发开拓新的应用领域。本研究在前期工作的基础上 ,在分子水平上探讨ＰＳＰ对单纯疱疹病毒 1型(ＨＳＶ 1)的作用及可能的机制 ,现将结果报告如下。1 材料与方法1.1 药品和试剂螺旋藻多糖 :参照文献 <3,4 >,采用改良的三氯乙酸去蛋白法提取螺旋藻多糖 ,纯度达 92 %以上。以双蒸水配成 10 ｇ/Ｌ母液 ,过滤除菌 ,分装 ,4℃保存 ,临用时以ＲＰＭＩ 16 40培养液稀释至所需浓度。ＲＰＭＩ 16 40干粉培养基为美国ＧＩＢＣＯ公司产品 ;胰酶为ＡＭＥＲＳＣＯ公司产品 ;新生牛血清为杭州四季青公司产品 ;地高辛ＤＮＡ检测试剂盒为Ｒｏｃｈｅ公司产品。1.2 细胞株Ｖｅｒｏ细胞株由国家农业部动物检疫所惠赠 ,于ＲＰＭＩ 16 40基础培养液中加入体积分数为 0 .10的新生牛血清 ,1× 10 5Ｕ/Ｌ青霉素 ,10 0ｎｇ/Ｌ链霉素 ,置 37℃体积分数为 0 .0 5的ＣＯ2 孵箱中培养 ,3ｄ传代 1次。1.3 病毒标准ＨＳＶ 1的ＳＭ 4 4株来源于中国协和医科大学。在Ｖｅｒｏ细胞中传代 ,毒种保存于 - 70℃ .测定病毒滴度 ,以ＴＣＩＤ50 表示病毒毒力。其方法为取上述制备好的毒株 ,做 10倍系列稀释为 10 - 1～10 - 10 .将各稀释度的毒株接种于Ｖｅｒｏ细胞 ,各 6复孔 ,同时设阴性对照。 37℃培养 3ｄ后 ,观察细胞病变 ,以出现细胞病变的最高稀释倍数的倒数作为ＴＣＩＤ50 .1.4 仪器和设备ＣＯ2 孵箱 (美国ＳＨＥＬＬＡＢ公司 ) ,倒置显微镜(ＯＬＹＭＰＵＳ) ,电子分析天平 (Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ) ,低温高速离心机 (德国Ｈｅｒａｃｕｓ公司 )。1.5 ＨＳＶ 1感染Ｖｅｒｏ细胞样本的制备Ｖｅｒｏ细胞制成 2× 10 8/Ｌ细胞悬液 ,接种在放有盖玻片的培养瓶中培养 ,每组 6瓶细胞 ,12块飞片 ,每瓶加入 1.8ｍＬ细胞 ,于体积分数为 0 .0 5的ＣＯ2 孵箱 37℃培养 2 4～ 4 8ｈ ,弃生长液 ,加约 10 0倍的ＴＣＩＤ50 病毒液 10 0 μＬ,37℃吸附 2ｈ ,吸出病毒液 ,加用维持液稀释的不同稀释度的ＰＳＰ 2 0 0 μＬ ,于体积分数为 0 .0 5的ＣＯ2 孵箱 37℃培养 2 4ｈ ,取出细胞飞片经 4 0 ｇ/Ｌ多聚甲醛室温下固定 30ｍｉｎ ,梯度乙醇脱水 ,- 70℃冻存备用。1.6 寡核苷酸探针的设计与制备根据ＧｅｎｅＢａｎｋ中ＨＳＶ 1全基因序列 ,设计对应于ＨＳＶ 1糖蛋白 ｇＧ基因序列的寡核苷酸探针 ,探针序列为 5′ ＴＴＣＣＣＡＣＣＡＡＣＧＴＣＴＣＣＴＣＣＡＣ ＣＡＣ 3′ ,由上海生工生物技术公司合成 ,并在 5′标记地高辛。1.7 原位杂交程序细胞飞片以ＰＢＳ漂洗 2次 ,1ｎｇ/Ｌ蛋白酶Ｋ于37℃消化 30ｍｉｎ ,ＰＢＳ漂洗 2次 ,4 0ｇ/Ｌ多聚甲醛室温下固定 10ｍｉｎ ,2×ＳＳＣ冲洗 2次 ,梯度乙醇脱水 ,空气干燥。每张飞片滴加 5 0 μＬ杂交液 ,预杂交2ｈ ;加入含探针 (1～ 2 )× 10 - 15ｇ/Ｌ杂交液 ,置于密闭湿盒中 ,6 0℃过夜。杂交结束后 ,飞片在室温下依次经 2×ＳＳＣ ,1×ＳＳＣ ,0 .5×ＳＳＣ漂洗各 2次 ,于ＢｕｆｆｅｒⅠ洗液中 10ｍｉｎ ,封闭液ＢｕｆｆｅｒⅡ中 37℃孵育 30ｍｉｎ ,加入抗体液 37℃孵育 30～ 6 0ｍｉｎ ,ＢｕｆｆｅｒⅠ洗液中 10ｍｉｎ ,置ＢｕｆｆｅｒⅢ平衡 10ｍｉｎ ,新鲜配制的显色液中避光孵育 10ｍｉｎ至数小时 ,终止反应。中性树胶封片。实验同时设 3个阴性对照 :杂交前用ＲＮａｓｅＡ10 0ｎｇ/Ｌ预处理细胞飞片 ,37℃ 1ｈ ;加未标记的探针进行反应 ;正常的Ｖｅｒｏ细胞。阳性对照为未加ＰＳＰ作用的ＨＳＶ 1感染Ｖｅｒｏ细胞组。所有操作步骤与其他样本相同。结果判定 :4 0 0倍光镜下随机选择视野 ,观察2 0 0个细胞 ,计数杂交阳性的细胞数。阳性信号呈明亮的蓝紫色。1.8 统计学处理 结果以 ｘ±ｓ表示 ,多组比较采用方差分析。2 结 果光镜下观察 ,可见表达ＨＳＶ 1型糖蛋白 ｇＧ基因的Ｖｅｒｏ细胞被染成蓝紫色 ,染色部位位于细胞浆(图 1)。不同剂量ＰＳＰ作用于ＨＳＶ 1感染组糖蛋白 ｇＧｍＲＮＡ的表达均显著低于阳性对照组 (Ｆ =1319.1,ｑ =6 7.2 8,6 9.2 1,83.0 6 ,Ｐ <0 .0 1) ,且随药物浓度的增加其抑制率明显增高 ,见表 1.3 讨 论我们的前期研究工作发现 ,ＰＳＰ对Ｖｅｒｏ细胞无明显的毒性 ,可明显阻滞ＨＳＶ 1向细胞吸附 ,并能有效地抑制病毒复制 ,但并不影响病毒的释放。ＨＳＶ 1为双股ＤＮＡ病毒 ,其复制是一个相当复杂图 1 原位杂交结果①正常Ｖｅｒｏ细胞 ;② 40ｎｇ/ＬＰＳＰ作用于ＨＳＶ 1感染Ｖｅｒｏ细胞 ;③ＨＳＶ 1感染Ｖｅｒｏ细胞表 1 ＰＳＰ对ＨＳＶ 1糖蛋白 ｇＧｍＲＮＡ表达的影响组别ｎｍＲＮＡ表达 (% )ＨＳＶ阳性对照组 672 .67± 1.3 7ＰＳＰ(10ｎｇ/Ｌ) 64 2 .17± 1.83 ＰＳＰ(5 0ｎｇ/Ｌ) 63 1.17± 0 .89 ＰＳＰ(10 0ｎｇ/Ｌ) 62 2 .67± 1.63 与阳性对照组比较 ,Ｆ =13 19.1, ｑ =67.2 8,69.2 1,83 .0 6,Ｐ<0 .0 1但又十分程序化的过程。已知ＨＳＶ 1糖蛋白 ｇＧ与病毒的侵入和释放以及病毒在细胞间的传播有关 ,为进一步研究ＰＳＰ抗ＨＳＶ 1作用的分子机制 ,本研究设计对应于ＨＳＶ 1糖蛋白 ｇＧ基因序列的寡核苷酸探针 ,进行原位杂交 ,结果表明不同浓度的ＰＳＰ均可明显抑制ＨＳＶ 1糖蛋白 ｇＧｍＲＮＡ的表达 ,从而影响ＨＳＶ 1糖蛋白 ｇＧ基因的转录 ,进一步从分子水平直接证明ＰＳＰ可抑制ＨＳＶ 1的侵入和释放等。临床应用的抗疱疹病毒药物主要为核苷类衍生物 ,多通过单一环节抑制病毒复制 ,如作用于病毒的ＤＮＡ合成酶 ,它们以酶反应底物类似物的形式与正常底物竞争 ,掺入病毒核酸链 ,造成病毒核酸复制中断 ,发挥抑制病毒作用 ,但易产生耐药性、副作用大<5,6 > 。因此 ,研究作用于病毒基因复制、转录及转译等多环节的药物和制剂是当今国内外开发抗病毒药物的热点。由于ＰＳＰ为天然化合物 ,具有无毒、高效的特点 ,明显不同于常用抗病毒药物 ,同时兼有抗病毒和免疫调节双重作用 ,在发展新型抗病毒药物中具有十分重要的意义 ,有合成药物所不具有的优点。因此 ,ＰＳＰ作为一种高效低毒的抗病毒药物 ,值得进一步研究和开发 ,具有广阔的应用前景。PSP对HSV-1糖蛋白gG mRNA表达的抑制作用@于红$青岛大学医学院微生物学教研室!青岛266021螺旋藻多糖;;单纯疱疹病毒1型,人;;原位杂交①目的 探讨钝顶螺旋藻多糖 (PSP)对单纯疱疹病毒 1型 (HSV 1)糖蛋白 gGmRNA表达的影响及其机制 ,为进一步开发该药提供理论依据。②方法 以不同剂量的PSP作用于适量HSV 1感染的Vero细胞 ,应用地高辛标记寡核苷酸探针 ,检测HSV 1糖蛋白gGmRNA的表达。③结果 PSP作用组HSV 1糖蛋白gGmRNA的表达显著低于阳性对照组 (F =1319.1,q =6 7.2 8,6 9.2 1,83.0 6 ,P <0 .0 1)。 ④结论 PSP抗HSV 1作用的机制之一为抑制HSV 1糖蛋白gG基因的转录1HayashiK ,HayashiT ,KojimaI.Anaturalsulfatedpolysaccha ride,calciumspirulan,isolatedfromSpirulinaplatensis:invitroandexvivoevaluationofanti herpessimplexvirusandanti humanim munodeficiencyvirusactivities
.AIDSResHumRetroviruses,1996,12(15):1463
2HayashiT ,HayashiK ,MaedaM ,etal.Calciumspirulan,anin hibitorofenvelopedvirusreplication,fromablue greenalgaSpiruli naplatensis.JNatProd,1996,59(1):83
3LeeJB ,HayashiT ,HayashiK ,etal.Furtherpurificationandstructuralanalys isofcalciumspirulanfromSpirulinaplatensis.JNatProd,1998,61(9):1101
4章银良,李红旗,高 峻,等.螺旋藻多糖提取新工艺的研究.食品与发酵
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