肾缺血再灌注 (ＩＲ)损伤是指肾组织在缺血时和恢复血液灌注时所发生的损伤。临床见于大失血、肾移植、肾脏 手术等。补气养血活血中药黄芪、当归被广泛应用于肾脏疾病的治疗。近年来研究表明黄芪、当归对急性缺血再灌注性肾损伤有一定的保护作用。其机理多认为黄芪、当归有抗自由基作用,利于减轻对肾脏细胞的损害 ;抑制ＴＸＡ2 产生和血小板集聚作用 ;改善肾脏的微循环等<1> 。本实验采用家兔肾缺血再灌注损伤模型 ,观察黄芪、当归对肾组织中肿瘤坏死因子 (ＴＮＦ α)、
碱性成纤维细胞生长因子 (ｂＦＧＦ)含量的影响。旨在探明黄芪、当归是否通过对上述两种细胞因子的调节而发挥改善肾功能的作用。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 实验动物 健康成年日本大耳白兔 34只 ,雌雄不拘 ,体重 1.3～ 2 .2ｋｇ。1.1.2 药品与试剂 黄芪注射液 :成都地奥九泓制药厂川卫药准字 (1994 )第 0 10 349号 ,批号 990 1115(每支 10ｍＬ ,相当于原生药 2 0 ｇ)。当归注射液 :山西省永济制药厂晋卫药准字 (1996 )第 0 5 10 2 5号 ,批号 980 82 4 2 6 (每支 2ｍＬ ,每 1ｍＬ相当于原药材0 .0 5 ｇ)。肌酐 (Ｃｒ)、ＴＮＦ α ,ｂＦＧＦ检测试剂盒分别由重庆医学检测试剂研究所、第四军医大学免疫教研室和Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ生产。1.1.3 仪器 酶标仪 (美国Ｂｉｏ ＴＥＫＥＬＸ80 0型 ) ;透射电镜 (日本日立ＪＥＭ 10 0ＳＸ型 ) ;紫外分光光度计 (日本岛津ＵＶ 2 0 0Ｓ型 ) ;低温离心机 (日本久保田ＫＲ 180ＦＡ型 )。1.2 方法 34只动物随机均分至假手术对照 (对照 )组、单纯缺血再灌注 (ＩＲ模型 )组、黄芪注射液处理 (
黄芪 +ＩＲ)组、当归注射液处理 (
当归 +ＩＲ)组。分别于术前 1ｄ、手术当天、术后 1ｄ每天耳缘静脉注射 1次药物 ,黄芪 +ＩＲ组注射黄芪 1.2 5 ｇ·ｋｇ- 1+生理盐水至每次 5ｍＬ·ｋｇ- 1;当归 +ＩＲ组注射当归12 .5ｍｇ·ｋｇ- 1+生理盐水至每次 5ｍＬ·ｋｇ- 1。对照组和ＩＲ模型组按上述方法注射生理盐水每次 5ｍＬ·ｋｇ- 1。用 1%戊巴比妥钠 2 .5ｍＬ·ｋｇ- 1耳缘静脉注射麻醉兔 ,无菌条件下开腹 ,去左肾。除对照组外 ,其余各组右肾动脉夹闭 1ｈ。去夹恢复血液再灌注。于再灌注后 4 8ｈ击昏动物 ,下腔静脉取血分离血清 ,测Ｃｒ含量。取右肾上极组织置入 3%戊二醛中固定做电镜检查。取右肾下极组织 0 .5 ｇ加 4℃双蒸水 4 .5ｍＬ ,在 4℃条件下用电动匀浆机 10 0 0 0～ 2 0 0 0 0ｒ·ｍｉｎ- 1研磨制成 10 %的组织匀浆 ,将匀浆用低温离心机以 30 0 0～ 4 0 0 0ｒ·ｍｉｎ- 1离心 10～15ｍｉｎ后 ,取适量上清液检测肾组织中的ＴＮＦ α和ｂＦＧＦ含量。Ｃｒ含量检测用苦味酸法 ,ＴＮＦ α和ｂＦＧＦ含量按各试剂盒说明书用ＥＬＩＳＡ夹心法检测。统计处理凡计量资料均以ｘ±ｓ表示 ,采用ｔ检验进行组间比较 ,以Ｐ <0 .0 5表示差异在统计学上有显著性意义。2 结果2 .1 电镜观察 对照组肾小球毛细血管、滤过屏障、近曲小管上皮细胞及细胞器结构正常。ＩＲ模型组肾小球血管内皮细胞变薄 ,基层膜明显增厚 ,足细胞突起融合、消失 ,肾小囊腔狭窄 ,肾小球体积缩小 ;肾小管上皮细胞相邻面的相嵌连结减少 ,基层膜皱褶减少至消失 ,线粒体数量少 ,密度增加 ,胞质中有大量空泡 ,内质网扩张 ,核固缩 ,核膜不光滑 ,核异染色质致密块状位于核膜下。黄芪 +ＩＲ组肾小球结构正常 ;肾小管上皮细胞基膜明显 ,未见明显增厚 ,胞质中发现少量空泡 ,部分线粒体电子密度增高 ,细胞间隙未见明显增宽。当归 +ＩＲ组肾小球未见明显病理改变 ;肾小管上皮细胞基膜明显 ,未见增厚 ,细胞器丰富 ,空泡少 ,可见溶酶体 ,线粒体电子密度未见明显增高 ,细胞间隙略增宽。2 .2 肾缺血再灌注 4 8ｈ各组血清Ｃｒ含量测定 ＩＲ模型组Ｃｒ含量显著高于对照组 (Ｐ <0 .0 5 ) ;黄芪 +ＩＲ组、当归 +ＩＲ组Ｃｒ含量与ＩＲ模型组比较明显降低 (Ｐ <0 .0 5 ) ,与对照组比较差异无显著性 (Ｐ>0 .0 5 ) ;黄芪 +ＩＲ组与当归 +ＩＲ组比较差异无显著性 (Ｐ >0 .0 5 ) (见表 1)。2 .3 肾缺血再灌流 4 8ｈ肾组织中ＴＮＦ α含量 ＩＲ模型组ＴＮＦ α含量高于对照组 (Ｐ <0 .0 5 ) ;黄芪 +ＩＲ组、当归 +ＩＲ组ＴＮＦ α含量低于ＩＲ模型组 (Ｐ<0 .0 5 ) ,甚至低于对照组 (Ｐ <0 .0 5 ) ;黄芪 +ＩＲ组与当归 +ＩＲ组较差异无显著性 (Ｐ >0 .0 5 ) (见表1)。2 .4 肾缺血再灌流 4 8ｈ肾组织中ｂＦＧＦ含量 ＩＲ模型组ｂＦＧＦ含量低于对照组 (Ｐ <0 .0 1) ;黄芪 +ＩＲ组、当归 +ＩＲ组ｂＦＧＦ含量高于ＩＲ模型组 (Ｐ <0 .0 1) ,其中当归 +ＩＲ组ｂＦＧＦ含量甚至高于对照组和黄芪 +ＩＲ组 (Ｐ <0 .0 5 ) (见表 1)。表 1 肾缺血再灌流 4 8ｈ ,各组血清Ｃｒ,肾组织湿重中ＴＮＦ α ,ｂＦＧＦ含量ｘ±ｓ组别ｎ Ｃｒ/μｍｏｌ/ＬＴＮＦ α含量 /ｎｇ·ｇ- 1ｂＦＧＦ/ｎｇ·ｇ- 1对照组 868.42± 19.2 41 ) 3 6.94± 5 .741 ) 19.41± 1.5 0 1 )ＩＲ模型组 896.11± 2 7.2 15 9.0 4± 2 5 .92 14 .3 9± 2 .61黄芪 +ＩＲ组 871.3 2± 16.461 ) 2 5 .13± 5 .171 ,2 ) 19.2 1± 1.83 1 ,2 )当归 +ＩＲ组 971.3 8± 14 .961 ) 2 6.5 3± 3 .491 ,2 ) 2 1.3 5± 2 .10 1 ,2 ,3) 注 :与ＩＲ组比较 1 ) Ｐ <0 .0 5 与对照组比较 2 ) Ｐ <0 .0 5 与黄芪 +ＩＲ组比较 3) Ｐ <0 .0 53 讨论黄芪益气而行血 ,扶正驱邪 ,固摄 ,生肌 ;当归补血、活血 ,祛瘀而生新。均为常用补益中药 ,用于治疗气虚、血虚、血瘀之证。肾ＩＲ损伤以及机体失血、中毒性休克、肾移植、肾手术等均属于气血虚弱而兼有瘀血阻滞的证候。既往报道黄芪、当归具有改善肾血流灌注 ,减轻肾小管间质损伤 ,降低血清尿素氮和肌酐上升幅度、减少尿蛋白 ;升高血超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性、降低肾组织钙和丙二醛含量 ,抗自由基 ;保护红细胞变形能力、抑制ＴＸＡ2 产生和血小板集聚并促进起解聚 ;阻断ＴＸＡ2对入球小动脉的强烈收缩 ,改善肾脏微循环 ;以及增加细胞内ＭＡＰＫｓ信号转导通路中ｃ ｊｕｎ氨基末端激酶的活性 ,减轻细胞损伤和促进肾小管上皮细胞修复等多种功效<1> 。对于肾ＩＲ损伤的治疗 ,既往多采用消除肾缺血原因 ,尽早恢复血流 ;改善肾组织的代谢 ;清除自由基 ;减轻Ｃａ2 +超载 ;以及细胞保护剂的使用等<2 > 。近年来采用细胞因子治疗急性肾ＩＲ损伤已取得显著效果<3> 。ＴＮＦ α可通过ＴＮＦ受体与内皮细胞连接 ,致使肾小球内皮细胞受损。激活状态下的巨噬细胞和内皮细胞在ＴＮＦ α的作用下 ,可发生一系列脱颗粒反应 ,导致许多蛋白酶及髓过氧化物酶等物质的释放 ,引起肾组织的损伤。ＴＮＦ α在血中的含量与慢性肾炎临床症状有关<4 ,5> 。在肾ＩＲ时 ,内源性ｂＦＧＦ含量的减少与损伤的严重程度成正比。ＩＲ过程降低ｂＦＧＦ的基因表达 ,导致内源性ｂＦＧＦ的产生减少 ,不利于肾损伤后的自我修复。本实验结果显示 ,肾ＩＲ损伤时 ,血浆中Ｃｒ、肾组织中ＴＮＦ α含量显著升高 ,ｂＦＧＦ显著降低。黄芪、当归可能通过调节ＴＮＦ α与ｂＦＧＦ两种细胞因子而发挥其改善肾功能的作用。黄芪 +ＩＲ组、当归 +ＩＲ组ＴＮＦ α显著低于对照组 ,是否提示黄芪、当归对肾ＩＲ时ＴＮＦ α有较强抑制作用 ,尚有待进一步研究阐明。黄芪、当归对家兔肾缺血再灌注损伤时TNF-α,bFGF的调节作用@徐晓玉$重庆医科大学药学系!重庆410061
@李莉华$泸州医学院生理教研室!四川泸州646000
@邬丽莎$泸州医学院生理教研室!四川泸州646000
@赵春玲$泸州医学院生理教研室!四川泸州646000
@林海英$泸州医学院生理教研室!四川泸州646000当归;;黄芪;;肿瘤坏死因子;;碱性成纤维细胞生长因子;;缺血再灌注目的 :探讨黄芪、当归对兔肾缺血再灌注 (IR)损伤的防治作用机制。方法 :健康成年日本大耳白兔 34只 ,随机均分至假手术对照 (对照 )组、IR模型组和黄芪 +IR组、当归 +IR组。在肾缺血 1h再灌注 4 8h取肾组织作电镜检查 ,并测血清肌酐 (Cr)、肾组织肿瘤坏死因子 (TNF α)和碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)含量。结果 :IR模型组肾组织变性改变显著 ,黄芪 +IR组、当归 +IR组病变轻微 ;IR模型组血清中Cr、肾组织中TNF α含量较对照组显著增高 ,bFGF显著降低。黄芪 +IR组、当归 +IR组Cr、TNF α含量较IR模型组降低 ,bFGF增高。结论 :黄芪、当归防治肾IR损伤的作用机制可能与其对TNF α和bFGF等细胞因子的调控有关。<1> 盛梅笑,李惊子,王海燕,等.黄芪、当归对缺血再灌注大鼠肾损伤的治疗作用.中国中西医结合杂志,20
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