DNA分子鉴别的第一步就是要获得高质量的可作为 PCR模板的 DNA。药材不同于新鲜的动植物材料 ,药材的干燥、加工、贮藏等过程均造成了DNA不同程度的降解 ;同时药材中的蛋白质、多糖以及多酚类化合物等都是影响 PCR成败的因素。因此 ,针对不同药材采用不同的 DNA提取方法才是科学、合理的。升麻 Cimicifuga foetida L.为根茎类药材 ,但不同于薄壁细胞较丰富的人参、黄精等药材 ,其木质部较发达 ,另外在升麻中多酚类物质又极其丰富 ,按常规的植物 DNA提取方法 <1>所获得的 DNA溶液呈褐色 ,无法进行 PCR。为获得高质量的药材DNA,结合升麻药材的特点探讨了木质部发达的根及根茎类药材的总 DNA提取方法。1 材料和方法1 .1 实验材料 :供试升麻样品分别购自浙江、山东、河南、江苏省 ,详细来源见表 1 ,保存于中国药科大学中药标本馆。木 Arlia chinensis L.、木香 Auck-landia lappa Decne.、乌药 Lindera aggregata( Slms) Kostern.、芍药 Paeoniae lactiflora Pall.、木通 Akebia quinata Decne.为第二军医大学南京军医学院标本馆馆藏标本。样品用 70 %己醇擦洗表面 ,或轻轻刮去表面的污染物后 ,切成小碎块备用。表 1 升麻实验材料的来源编号来源 (省份 )时间J1南京市百信药房 (江苏 ) 2 0 0 0 -0 9J2南京市健康中西药店 (江苏 ) 2 0 0 0 -0 9ZH 海宁市药材公司 (浙江 ) 2 0 0 0 -0 4ZD东阳市中药房 (浙江 ) 2 0 0 0 -0 4SW 潍坊医药公司 (山东 ) 2 0 0 0 -0 4HZ郑州医药公司医药大厦 (河南 ) 2 0 0 0 -0 41 .2 试剂 :1 0 0 mmol/ L Tris- HCl,7.5 mol/ LNH4OAc,2 0 % PVP( polyvinylpyrrolidone) ,1 0 0mmol/ L Na OAc( p H 6.0 ) ,3 mol/ L Na OAc,5mol/ L Na Cl。1 .3 药材总 DNA的提取 :全提取过程主要由洗净、抽提和纯化 3部分组成。洗净 :称取药材 1 0 0 mg,用液氮研磨成细粉后 ,放入 2 m L离心管中 ,加入 1 m L 1 0 0 mmol/ L Tris-HCl缓冲液混匀 ,室温静置 1 0 min,1 2 0 0 0 r/ min离心 5 min,弃上清 ,重复 1～ 2次。抽提 :在洗净处理过的样品中加入 1 / 2倍体积(约 5 0 0 μL)的 CTAB提取液 ( 2 % CTAB,5 0mmol/ L Tris- HCl) ( p H 8.0 ) ,2 0 mmol/ L EDTA( p H 8.0 ) ,1 .4mol/ L Na Cl,充分混合 ,5 6℃温育40～ 60 min。加入 2 0 % PVP使终浓度达到 6% ,再加入 1 / 1 0倍体积的 7.5 mol/ L NH4OAC并于 - 2 0℃放置 30 min后 ,1 2 0 0 0 r/ min离心 5min。取上清 ,加入等体积的苯酚 -氯仿 -异丙醇( 2 5∶ 2 4∶ 1 )颠倒混匀 ,40 0 0 r/ min离心 1 5 min后 ,再用 1 2 0 0 0 r/ min离心 1 0 min。在离心所得上清中加等体积的异丙醇 ,- 2 0℃培养 1～ 2 h,1 2 0 0 0 r/ min离心 1 0 min。纯化 :用 40 0 μL 1 0 0 mmol/ L ( p H 6.0 )Na OAc溶解沉淀 ,缓缓加入 1 / 1 0体积的无水己醇 ,1 2 0 0 0 r/ min离心 1 0 min。上清再加入 2 .5倍体积的无水己醇沉淀 DNA。沉淀用 45 0 μL TE缓冲液A ( p H 8.0 ,1 0 mmol/ L Tris- HCl,0 .1 mmol/ LEDTA,1 mmol/ L Na Cl)溶解后 ,再加入 1 / 1 0体积的 1 0 % CTAB、1 / 1 0体积的 5 mol Na Cl、1 / 3体积的 CHCL3 混合抽提 ,轻轻颠倒混匀 5 min 后1 2 0 0 0 r/ min离心 5 min。加入 1 / 1 0体积 3mol/ LNa OAc和 2 .5倍体积 1 0 0 % Et OH 沉淀 DNA,2 0～ 30 μL 的 TE缓冲液 B( p H8.0 ,1 0 mmol/ LTris- HCl,0 .1 mmol/ L EDTA)或 dd H2 O溶解备用。1 .4 DNA的检测 :取 DNA溶液 5～ 1 0μL点样于1 %的加入 EB琼脂糖凝胶上电泳 ,紫外观察并拍照。2 结果和讨论采用上述方法提取升麻药材样品的总 DNA,结果见图 1。此外对药材性状上质地较硬、组织解剖学上为木质部所占横断面的比例较大的根类药材、茎木类药材应用上述提取方法进行了 DNA提取实验 ,实验药材分别为木、木香、乌药、芍药和木通 ,提取结果见图 2。1～ 6分别为样品 ZD、ZH、J1、J2、HZ和 SW;M1和 M2分别为λ-Hind digest和 DL 2 0 0 0图 1 从 6个升麻样品中提取的总 DNA的电泳结果 植物中的多酚类化合物和多糖对于 DNA质量的影响 ,是植物分子生物学研究中最常遇到、必须解决的问题 ,许多学者对于不同的植物作过研究报道 <2～ 4>。中药材的特性又使得这一问题更为突出 ,即从药材中提取高质量的 DNA并非易事。本提取方1～ 6分别为木、木香、乌药、芍药和木通的总 DNA;M1和 M2分别为 λ-Hind digest和 DL 2 0 0 0图 2 从生药中提取的总 DNA的电泳结果法能较好的除去色素、多糖等干扰 PCR的物质 ,获得 DNA可直接用于 PCR扩增 (升麻的 DNA分子鉴定另行发表 )。首先 ,本法采用 1 0 0 mmol/L Tris- HCl ( p H8.0 )进行前洗净操作。该操作可在 DNA溶出前去掉水溶性和部分脂溶性色素以及部分多糖 ,比在DNA溶出后进行分离去除效果更佳。一般对于新鲜的植物材料采用加入β-巯基己醇防止多酚类物质的氧化 (褐变 ) ,但由于对于药材中的多酚类物质已被氧化 ,因此参照 Couth<5> 等的方法 ,采用加入 6% PVP及 7.5 mmol/L NH4OAc分离已被氧化的多酚类 ,获得 DNA溶液的颜色明显变浅。获得的 DNA溶液常常粘度大乃至呈胶状 ,是植物 DNA提取中最常见的现象 ,其原因是 DNA沉淀过程中多糖也同时被沉淀下来。植物 DNA的提取不同于动物细胞 ,如何更能有效的去除植物中特有的多糖 ,是获得高质量植物 DNA的关键。CTAB即可裂解细胞 ,又能有效的沉淀多糖 ,是最常采用的植物 DNA提取方法。但对于多糖极为丰富的材料 ,单靠 CTAB还不能获得高质量的 DNA。本研究通过以下两步操作 ,可明显去除多糖 ;1 ) DNA沉淀用 1 0 0 mmol/L Na OAc溶解后 ,利用在低浓度己醇中多糖可被沉淀而 DNA保留在溶液中的原理 ,分离出多糖 ;2 )采用 1 /1 0倍体积 1 0 % CTAB、1 /1 0倍体积的 5 mol Na Cl、1 /3倍体积的 CHCl3 抽提。Mizukami<6>曾报道了从生药中提取 DNA的方法 ,在对提取液进行一次氯仿抽提后 ,使用 DNA纯化试剂盒获得总 DNA。 Fu<7> 等报道采用两步离心法可获得长片段的 DNA,从文章的电泳图可见DNA片段达 2 0 kb以上 ,从生药中获得如此长片段的 DNA,可能是值得进一步验证的。此外 ,本方法所用的试剂均为常用、低价格 ,为药材 DNA分子鉴定法的应用奠定了基础植物药材总DNA提取@李晓波$上海交通大学药学院!上海200030,中国药科大学中药学院,江苏南京210038
@冯波$中国药科大学中药学院!江苏南京210038
@张朝晖$第二军医大学南京军医学院!江苏南京210099
@王峥涛$中国药科大学中药学院!江苏南京210038
@徐珞珊$中国药科大学中药学院!江苏南京210038DNA提取;;中药材;;升麻目的 为获得高质量的 DNA,研究木质部较发达的根、根茎类以及茎木类药材的 DNA提取方法。方法 总 DNA的提取过程包括用 Tris缓冲液洗净、CTAB抽提和纯化。结果 对升麻、木、木香、乌药、芍药和木通等进行了
DNA提取 ,能较好的去除色素、多糖等干扰 PCR物质。结论 本法使用常用试剂 ,成本低 ,易于推广 ,为药材 DNA分子鉴别的应用奠定了基础<1> ClarkM S.植物分子生物学——实验手册
.北京:高等教育出版社,施普林格出版社,1998.
<2> 罗志勇,周 钢,陈湘辉,等.高质量植物基因组DNA的分离.湖南医科大学学报,2001,26:178-180.
<3> GreenM J,ThompsonD A,MackenzieD J.Easy and efficientDNA extraction from woody plants for the detection of phyto-plasmas by polymerase china reaction.PlantDisease,1999,83:482-
More abstracts about the 植物药材总DNA提取