我们研究了人参四逆汤药效的物质基础 ,曾报道人参四逆汤中甘草和干姜对附子双酯型生物碱水解的影响等论文<1> 。我们又发现人参四逆汤的提取组分 S- 1和 S- 7能使失血性休克动物血压缓慢回升 ,延长动物存活时间 ,给药后动物存活时间达 6h以上 ,达到长期存活 ,与盐水组比有明显差异 ,人参四逆汤的提取组分 S- 1和 S- 7具有明显的抗失血性休克的作用。本实验结合硅胶色谱柱分离 ,利用ESI/MSn、MALDI- TOF/MS等技术分析鉴定人参四逆汤的提取组分 S- 7和 S- 1的化学成分的结果。1 试验部分1 .1 仪器与材料 :LCQ电喷雾质谱仪 (美国 Finni-gan MAT公司 ) ,LDI- 1 70 0型激光解析飞行时间质谱仪 (美国 ) ,柱层析和薄层层析用硅胶 G(青岛海洋化工厂 ) ,试剂均为分析纯。红参 Panax ginseng C.A.Mey.,甘草 Gly-cyrrhiza ulalensis Fisch.,干姜 Zingiber officinaleRosc.均购自长春市药材公司 ,附子 Aconitumcarmichaeli Debx.购自四川省江油药材加工厂 ,经长春中医学院邓明鲁教授鉴定 ,均符合 2 0 0 0年版《中华人民共和国药典》规定。1 .2 实验方法和结果1 .2 .1 人参四逆汤水煎剂的制备 :根据人参四逆汤配方比例附子 -干姜 -甘草 -红参 ( 1 0∶ 4.5∶ 6∶ 3) ,分别取适量药材 ,加 1 0倍量水浸泡 0 .5 h,煎煮保持微沸 1 h,过滤 ,收集滤液 ,滤渣加 8倍量水 ,煎煮保持微沸 1 h,过滤 ,收集滤液 ;滤渣加 6倍量水 ,煎煮保持微沸 1 h,过滤 ,合并 3次滤液 ,浓缩 ,得浓缩液( 1 g/m L)。1 .2 .2 抗休克作用有效组织 S- 1和 S- 7的提取和分离 :人参四逆汤水煎剂浓缩液用 65 %乙醇沉淀 ,滤过 ,回收乙醇 ,依次用乙醚和乙酸乙酯萃取 ,水层Na2 CO3 调 p H=1 0 ,分别依次用氯仿和乙酸乙酯萃取 ,水层盐酸调 p H=6,用水饱和正丁醇萃取 ,各萃取液回收溶剂 ,得 S- 1～S- 7提取物。经药理实验S- 1号和 S- 7号提取物具有明显的抗失血型休克作用。1 .2 .3 S- 1号提取物的 ESI/MSn、MALDI- TOF/MS分析 :人参四逆汤组方中的附子含有大量的生物碱 ,目前已分离鉴定出多种二萜生物碱和双酯型二萜生物碱 ,中国科学院长春应用化学所<2 ,3 > 利用质谱新技术 ( MALDI- TOF/MS和 ESI- MS/MS)具有的分离、定性及灵敏等方面的优势 ,进行了附子提取物中生物碱组成、相对含量的分析和鉴定的研究 ,积累了附子二萜类生物碱鉴定的数据 ,建立快速、灵敏、可靠的分析方法。为人参四逆汤生物碱组分的分析鉴定 ,提供了基础。在附子二萜生物碱和脂肪酸酯型二萜生物碱分析方法研究<1,2 > 的基础上 ,对人参四逆汤抗休克作用的有效组分 S- 1进行了 ESI/MSn、MALDI- TOF/MS分析 ,根据 ESI/MSn分析和多级串联技术( MSn,n<1 0 )提供的分子结构信息 ,分析结果如下 :
有效组分 S- 1主要有下列二萜生物碱成分组成 :苯甲酰次乌头碱油酸酯 ( 1 4- benzoylhypaconine- 8-linoleate,HAL )、苯甲酰去氧乌头碱油酸酯 ( 1 4-benzoyldeoxyaconine- 8- oleate,HAO)、苯甲酰次乌头碱棕榈酸酯 ( 1 4- benzoylhypaconine- 8- palmitate,HAP)、苯甲酰中乌头碱 ( benzoylmesaconitine,BM)、苯甲酰乌头碱 ( benzoylaconitine,BA)、苯甲酰次乌头碱 ( benzoylhypaconitine,BH)。1 .2 .4 抗休克作用的有效组分 S- 7的 ESI- MSn 和LC/MS质谱分析 :S- 7具有明显的抗休克作用 ,直接利用 ESI- MSn 和 LC/MS分析有一定的困难 ,经硅胶干柱分离 ,分得 1 3- a～h等组分。采用 ESI- MSn和 LC/MS质谱分析技术 ,利用 ESI可同时测定多个化合物的相对分子质量 ,并通过多级串联功能选择目标离子 ,进行多级碰撞 ,获得结构信息一次定性多个化合物。各组分含有成分的分析和鉴定的依据和结果如下 :1 3- a:由一级谱图可知 ,该组分中含有 Rb2 ,Rb3 ,Rc,以及 Rd和 Re。由 m/z 1 0 77离子的二级质谱可知 ,1 0 77离子即
-分别失去1个葡萄糖 ,2个葡萄糖 ,生成 -( m/z 945 )和 -( m/z783) ,由 m/z 945离子的三级质谱可知 ,945离子可失去 1个葡萄糖或 2个葡萄糖生成 783和 62 1两个离子 ,据此我们可推断 1 3- a中含有 Rb2 ,Rb3 ,Rc。由945离子的二级质谱可知 :945可产生 783,62 1两个碎片离子 ,分别是失去 1个葡萄糖 ,2个葡萄糖得到的离子 ,据此可推断该离子是 Rd,Re所产生的。同样方法可测定下列各组分的成分。分析结果表明1 3- a可检出 : 人参皂苷 Rd( MW=946) ,Re( MW=946) ,Rb2 ( MW =1 0 78) ,Rb3 ( MW =1 0 78) ,Rc( MW=1 0 78)。1 3- b:该组分中未测定到人参皂苷成分 ,主要是多种寡糖。1 3- c:由 m/z 1 0 77离子的二级质谱可知 ,1 0 77离子即 -分别失去 1个葡萄糖 ,2个葡萄糖 ,生成 -( m/z945 )和 -( m/z 783) ,由 m/z945离子的三级质谱可知 ,945离子可失去 1个葡萄糖或 2个葡萄糖生成 783和 62 1两个离子 ,据此我们可推断 1 3- c中含有 Rb2 ,Rb3 ,Rc。由 945离子 -的二级质谱可知 :945可产生 783,62 1两个碎片离子 ,分别是失去 1个葡萄糖 ,2个葡萄糖得到的离子 ,据此可推断该离子是 Rd,Re所产生的。分析结果表明 1 3- c含有 :人参皂苷 Rd( MW=946) ,Re( MW=946) ,Rb2 ( MW=1 0 78) ,Rb3( MW=1 0 78) ,Rc( MW=1 0 78) ,Rg2 ( MW=784) ,Rf( MW=80 0 ) ,Rg1( MW=80 0 ) ,Rg3 ( MW=80 0 )。1 3- d:对 1 3- d我们进行了液质联机表征 ,结果发现 ,相对分子质量相同的两个 m/z945离子有不同的保留时间 ,表明是两种不同的物质 ,分别为 Re和 Rd。 m/z 1 0 77表明 Rb3 ,Rc,Rb2 的存在 ,但由于三者结构极其相似 ,流动相选取的局限性使得三种物质没有分开。m/z799离子及其进一步碎裂产生的失去 2个葡萄糖的离子 m/z476-表明 Rf,Rg1,Rg3 的存在。分析结果表明 1 3- d含有人参皂苷 Rd( MW=946) ,Re ( MW =946) ,Rb2 ( MW =1 0 78) ,Rb3( MW=1 0 78) ,Rc( MW=1 0 78) ,Rg2 ( MW=784) ,Rg1( MW=80 0 ) ,Rg2 ( MW=784) ,Rg3 ( MW=80 0 ) ,Rf( MW=80 0 )。1 3- e:由质谱结果可知 ,该组分中含有 Rd、Re、Rb2 、Rb3 、Rc、Rg2 、Ra1、Ra2 、Rb1。m/z1 2 0 9的二级质谱表明该离子可失去一个木糖产生 -,根据一、二级质谱结果及文献结果可知 ,该组分中含有 Ra1、Ra2 。其他离子的分析同前。分析结果表明 1 3- e含有人参皂苷 Rd( MW=946) ,Re( MW=946) ,Rb2 ( MW=1 0 78) ,Rb3 ( MW=1 0 78) ,Rb1( MW=1 1 0 8) ,Rc( MW=1 0 78) ,Ra1( MW=1 2 1 0 ) ,Ra2 ( MW=1 2 1 0 ) ,Rg2 ( MW=784)。1 3- f:分析结果表明含有人参皂苷 Rd( MW=946) ,Re ( MW =946) ,Rb2 ( MW =1 0 78) ,Rb3( MW=1 0 78) ,Rc( MW=1 0 78) ,Rg2 ( MW=784) ,Ra1( MW=1 2 1 0 ) ,Ra2 ( MW=1 2 1 0 ) ,Rb1( MW=1 1 0 8)。离子的分析同前。1 3- g:含有人参皂苷 Rd( MW=946) ,Re( MW=946) ,Rb2 ( MW=1 0 78) ,Rb3 ( MW=1 0 78) ,Rc( MW=1 0 78) ,Ra2 ( MW=1 2 1 0 ) ,Rb1( MW=1
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