随着现代自然科学技术的发展 ,许多新学科理论和实验技术不断渗透到中药鉴别领域 ,极大地推动了中药鉴别的发展 <1 > ,其中高效毛细管电泳 (HPCE)是近十几年迅速发展起来的一种新型分离分析技术 ,具有分离效率高、分析速度快、分离模式多、所需样品少、应用范围广、自动化程度高的特点 ,在生命科学、生物技术、医学药物和环境科学等领域显示了极其重要的应用前景 ,目前正广泛应用于天然药物研究之中。本文结合国内文献综述近年来 HPCE技术在中药指纹鉴别中的应用进展。1 基本原理和分析特点HPCE是以高压电场为驱动力 ,以毛细管为分离通道 ,依据样品中各组分之间的淌度和分配行为的差异而实现分离的一类液相分离技术。仪器装置通常包括高压电源、进样系统、毛细管柱、检测器和记录系统 5部分 ,其中毛细管柱是分离的核心部分。研究与实践表明 ,HPCE与 HPL C相比具有以下特点 :(1)分离效率高 ,理论塔板数高达 10 6 ～ 10 7/ m ;(2 )分析速度快 ,一般在 2 0～ 30 min内可完成一次电泳操作 ;(3)应用模式多样 ,已经发展了毛细管区带电泳 (CZE)、胶束电动毛细管色谱 (MECC)等分离模式 ,扩大了 HPCE的应用范围 ;(4)样品用量少 ,仅为纳升级 ;(5 )灵敏度高 ,用激光诱导荧光检测器可达 10 - 2 4 的超低检出限。2 天然药材 HPCE指纹鉴别2 .1 蛋白多肽 :天然药材细胞中普遍存在多肽和蛋白质类物质 ,这些物质受遗传基因控制 ,其 HPCE图谱具有特征性 ,可以作为指纹图谱鉴别天然药材。有关蛋白质多肽HPCE方法用于指纹鉴别中药药材的相关报道见表 1。为了得到满意的指纹图谱 ,必须对蛋白质多肽的提取方法和有关实验参数进行优化。由于天然药物含有多种蛋白质多肽 ,不同蛋白的等电点不同 ,单一提取液很难将所有蛋白质一次完全提取出来。为了更全面反映其特征图谱 ,在提取蛋白时 ,可以分别用酸性抽提液、碱性抽提液及 Tris-甘氨酸蛋白抽提液来提取蛋白 ,它们的组成分别是 :碱性提取液为0 .1mol/ L Tris- HCl、0 .5 mol/ L 蔗糖、0 .1%抗坏血酸、10m mol/ L 巯基乙醇 ,p H8.0 ;酸性提取液为 80 mmol/ L 柠檬酸、32 mm ol/ L Na2 HPO4 、5 mm ol/ L 抗坏血酸、10 m mol/ L巯基乙醇 ,p H 2 .8;Tris-甘氨酸蛋白抽提液为 0 .6 g Tris、2 .88g甘氨酸加水溶解至 10 0 0 m L,p H8.5。在酸性、碱性提取液中常常加入抗氧化性的巯基乙醇和抗坏血酸 ,目的在于防止蛋白质的活性基团受到破坏。一般情况下采用 3种蛋白质抽提液提取天然药物中蛋白质和多肽 ,结合 3种不同提取液的 HPCE指纹图谱 ,基本上就可以实现对药材的指纹鉴别。邢旺兴 <6 >认为分别提取方法繁琐 ,同时抽提液中高强度的离子容易导致焦耳热的生成 ,于是尝试用水作为抽提液 ,结果表明水提取液能够客观反映水溶性蛋白的情况。还有采用大孔树脂法 <5>进行粗分后直接进行 HPCE分析 ,也可达到满意的分离效果。2 .2 其他成分 :王寅 <2 >等对不同居群大青叶药材的理化特征差异进行研究 ,结果表明异地栽培的不同居群大青叶药材的酸性提取部位的化学成分及含量有显著差异 ,依据电泳图特征峰的迁移时间和峰面积 ,能有效地鉴别不同居群大青叶药材。马晓强 <3>等对萱草、黄花菜、红花、番红花等 4种药材中的水溶性成分进行定性分析 ,结果显示种间有明显的差别 ,认为方法速度快 ,灵敏度高 ,重现性好 ,可作为“红花”类药材的定性鉴别方法。纪秀红 <1 8> 等发现枸骨叶与十大功劳叶的紫外 -可见光谱有明显区别 ,可用此方法鉴别枸骨叶与十大功劳叶 ,通过 HPCE法证实两者间紫外 -可见光谱的差异是由于化学成分的含量及其比例不同所致。王德先 <1 9> 等对中药天麻及其 4种常见伪品商陆、黄精、天花粉和十九股牛进行了鉴别 ,发现伪品均不存在天麻素 ,方法简便可行。表 1 蛋白多肽 HPCE指纹鉴别天然药材的条件和方法药 材检测成分 运行缓冲液(mmol/ L)毛细管柱(cm× μm)电 压(k V)检测方式(nm) 文 献同属不同种菟丝子酸溶蛋白、碱溶蛋白、 Tris-甘氨酸提取蛋白p H8.5硼酸盐 3 0 0 5 7× 75 3 0 2 0 0 412种海马、海龙类药材大孔树脂提取蛋白质 p H 3 .5磷酸盐 5 0 2 0× 2 0 112 0 0 5红曲水溶性蛋白 p H 9.11硼酸盐 2 0 5 7× 75 2 0 2 14 6蝎毒水溶性蛋白质 p H6.0磷酸盐 2 5— 2 0 DAD*检测 7云芝糖肽水溶性提取物 p H9.3硼酸盐 2 0或 p H 2 .5磷酸盐 5 05 0× 75 3 0 DAD检测 全波长扫描8生药狗脊、药材狗脊、黑狗脊和龙眼肉及其混淆品酸溶蛋白、碱溶蛋白、 Tris-甘氨酸提取蛋白p H8.5硼酸盐 3 0 0 60× 75 2 0 2 0 0 9,11榧子 ,三七及其混淆品菊叶三七 ,宁夏枸杞子与枸杞子酸溶蛋白、碱溶蛋白、 Tris-甘氨酸提取蛋白p H 8.5硼酸盐 15 0 60× 75 2 0 2 0 0 10 ,13 ,14 ,16乌梅与混淆品李子和紫苏子及其混淆品酸溶蛋白、碱溶蛋白、 Tris-甘氨酸提取蛋白p H8.5硼酸盐 3 0 60× 75 2 0 2 0 0 12 ,17娑罗子酸溶蛋白 p H 8.5硼酸盐 2 0 49× 5 0 3 0 2 0 0 15 * DAD:二极管阵列检测器 值得注意的是 ,天然药物中成分复杂多样化 ,小到阴阳离子 ,大到多糖、蛋白质 ,应用 HPCE技术可以对其中已知成分同时进行分析 <2 0 > ,但是如果样品处理过程中可能将多数未知成分除去 ,图谱中所含峰数较少 ,缺乏特征性 ,就不能作为其指纹图谱鉴别天然药物。3 存在的问题和应用前景HPCE指纹图谱分析中存在的不足之处主要是重现性差 ,降低了 HPCE在药物指纹鉴别的可靠性。因此在指纹鉴别过程中 ,必须提供标准样品才能对待检样品进行指纹鉴别 ,在某种程度上限制了 HPCE指纹鉴别的广泛应用。王天松 <2 1 > 提出在开发检测指纹图谱时 ,最好同时试验 HPCE和HPL C,择其优者。针对重现性差的问题 ,谢莹 <2 2 > 等提出采用淌度比法、对照品校正法、保留指数法等 3种方法来提高HPCE的重现性。真正实现对天然药物的快速指纹鉴别 ,必须建立不同品种药材的标准指纹图谱库和数据库。标准指纹图谱库的建立需要结合不同的分析手段 ,包括相关生物技术和化学计量学中的人工神经网络技术等。标准指纹图谱库和数据库的建立在天然 药物的指纹鉴别和中药制剂的质量控制中将会发挥十分重要的作用高效毛细管电泳指纹图谱鉴别天然药物研究进展@叶能胜$首都师范大学化学系!北京100037
@谷学新$首都师范大学化学系!北京100037HPCE;;天然药物;;指纹图谱;;指纹鉴别简介高效毛细管电泳 (HPCE)技术的基本原理 ,综述了 HPCE近年来在天然药物指纹鉴别中的应用 ,并讨论该技术在天然药物指纹图谱鉴别的应用前景<1> 汪仁望,吕 扬.现代中药鉴定方法研究进展
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