布洛芬(ibuprofen)、蔡普生(nap找)x en)、酮洛芬(ketoprofen)等属2一芳基丙酸类非街体抗炎药。其中具有药理作用的 是S(+)一异构体,而R(一)一异构体的作用小,有的还有毒副作用。因此,以单一对映体给 药已渐成趋势。除不对称合成外,外消旋体的拆分是获得手性药物的另一条重要途径。近年来,随 着生物技术和酶工程的发展,利用微生物酶进行药物对映体拆分已取得了长足的进步,尤其将固定 化、多相反应、膜反应器和基因克隆等新技术引人酶促反应系统使拆分更有效易行,成为手性药物 高技术产业的发展方向。近年来,我们在胶束酶学这一新兴交叉学科研究基础上,率先在国内开展 了含酶微乳液的凝胶固定化研究工作,制备出了具有超高活性的微乳液凝胶固定化脂肪酶〔’〕。 为了表征该固定化酶的立体选择性以及该固定化酶拆分2一芳基丙酸类药物(目前国内仍以外消旋 形式供药)的潜在能力,本文以布洛芬为2-芳基丙酸类药物的代表,以其与正辛醇(之所以选正 辛醇是因为微乳液凝胶固定化脂肪酶对其显示出高活性)的醋化反应为指示反应,通过研究布洛芬及其正辛醋各对映体在Chi司celOD分析柱上的保留行为,建立一个灵敏、快速、准确跟踪上述醋化反应转化率(。)及对映体过量 值(。。)的手性固定相(CSP)高效液相色谱方法(HPI尤)。用CSP一HrLC法拆分 2一芳基丙酸类药物对映体已有文献报道〔2一4〕。有关结果表明,用于布洛芬对映体分离的条 件与手性柱有很大关系。如采用N一3,5一二硝基苯甲酞一R一苯甘氨酸共价型手性柱拆分布洛 芬,则需柱前衍生
;采用Regi,(s,s)whe玫一。1手性柱则需在流动相中添加冰醋酸等。我们在研究中发现,通过变更流动相组成与配比可以在ChiraleelOD柱上实现布洛芬及其正辛醋的对映体分离,且各对映体的响应因子值相等。这一结果为用CSP一HPLC法跟踪测定酶促布洛芬立体选择性醋化反应。及其ee值提供了便捷。1仪器 Wateo 510 IIPLC泵,Waters 486紫外检测器,Millennium 2010色谱工作站,Chilaleel OD分析柱(5脚,25 .0 em x 4 .6rnm,Daieel Cha而eal Ind.Ltd .Japan)。2试药 脂肪酶L一1754、明胶G一2500、唬泊酸二辛醋磺酸钠(AOT)皆为siglla公司产 品,布洛芬纯品由山东新华制药厂提供,布洛芬正辛醋为自己合成产品,正己烷(色谱纯)由天津 四友公司生产,正辛醇、异丙醇、冰醋酸、磷酸二氢钾及磷酸氢二钠皆为分析纯,水为三蒸水。3布洛芬正辛醋的化学合成取布洛芬1 Inol置loomL圆底烧瓶中,加人过量的二氯亚枫,回流Zh,减压蒸馏出布洛芬酞氯。将1 mol的正辛醇及过量毗陡加至三角烧瓶中,冰水浴冷却下,滴加布洛芬酞氯1 .2 mol,滴加完毕后,在室温下搅拌lh,过滤,滤液浓缩后,进行柱(印一100目硅胶)层析分 离,洗脱剂为乙酸乙醋一石油醚(1:4),得产品布洛芬辛醋。经元素分析、红外、核磁共振验证为纯品。4微乳液凝胶固定化脂肪酶的制备有关固定化方法见文献〔1〕。微乳液组成为油一水一AoT(“:14:21)<,>。5消旋布洛芬的立体选择性醋化反应 从冰箱中取出切好的酶块,称重后(约309)放人在25℃下预保温的有0.1 mol.L一‘外消旋布洛芬5.otnL和0.1 mol.L一’正辛醇5.omL的loomIJ具塞锥形瓶中。放人恒温(25℃)振荡(转速1 00r’而n一’)水浴中反应4h后,取出0.ltnL并用正己烷定容至1,omL,经过滤后,取20拌L进样作色谱分析。剩余的9.gmL反应液进行酸碱滴定分析,由消耗碱的体积算得的。为35 .2%。6实验结果与讨论6.1布洛芬及其正辛醋对映体的色谱分离通过变更流动相组成与配比可 以实现在同一色谱柱上拆分布洛芬及其正辛醋对映体。不同色谱条件下,外消旋布洛芬及其正辛酷混合物在ChiralcelOD手性柱上的保留行为见图l所示。各对映体峰的归属是依据2一苯基丙酸对映体标准在该色谱柱 上的保留行为以及2一苯基丙酸对映体与手性固定相之间的相互作用模式推断的。该推断与实际样 品分析结果一致。6.2布洛芬及其正辛醋对映体的工作曲线分别以外消旋布洛芬及其正辛醋作外标,制作各对映体标准曲线。发现在1.25 x 10一3一2.5xlo一Zmol.L一,各对映体浓度范围内峰面积与浓度之间有很好的线性关系,回归分析的相关系数都达到0 .9998以上。此外,还发现布洛芬及其正辛醋各自的2个对映体的校正曲线是重合的,即fiR =fi“=关,fe“=fe“二fe,其中f为峰面积一浓度校正因子,R、s为对映异构体, i表示布洛芬,e表示布洛芬正辛醋。更为有趣的是,布洛芬的校正因子与其正辛醋的校正因子几 乎相等。这一结果大大简化了酶促醋化反应。及ee的计算,即可以用峰面积代替浓度按有关公式直接计算。6.3精密度试验对外消旋浓度为0.01mol·L一’的布洛芬及其正辛醋,在各自对映体色谱分离条件下分别做精密度试验。5次平行测 定数据表明:R构型与S构型布洛芬的RSD相等,均为0.68%;R构型与S构型布洛芬正辛醋的RSD也相等,均为0.82%。6.4讨论在图1一A条件下,布洛芬对映体能完全分开,但其正辛醋对映体却分不开。 虽然我们也能依据这一色谱分离结果算出布洛芬与正辛醇立体选择性醋化反应的。值及ee;值,但分析时间稍长。此外,流动相中的冰醋酸对Chi耐celOD手性柱有害。相比之下,在图1一B条件下,通过醋的对映体峰面积测定按有关公式求出。值及 ee。值较为有利,尤其是在低转化率条件下。当然跟踪醋也有它不利的一面,即酶促醋化反应液 中的布洛芬会滞留在色谱柱上,多次进样分析后会影响色谱柱的柱效。因此,数次进样后,需用含 50%异丙醇的正己烷流动相冲洗柱子。7酶促反应c及ee值测定7.1计算方法以某一转化率 下的醋化反应体系为样品,在布洛芬正辛醋对映体分离条件下进行色谱分离,由醋的对映体峰面积 ,按式(l)求出eee:eee=(「s>e一<尺>e)/(「S>e+<尺>e)(1)再 按式(2)求出。:。=l一(e)/(〔S〕i。+<丑>10)(2)其中 「R〕10及「s>i。表示布洛芬对映体初始浓度对应的峰面积(一经测出便可把它看成是常数 )。再根据式(3)求出ee;值:。=eci/(eei+eee)(3)7.2样品分析结果 对本文‘,5’,项下中样品进行5次平行分析,求得ee。=(72.9士1.2)%,。二34.6%,ee;=38.6%。该结果与用酸碱滴定法算得的。值(35.2%)以及在布洛芬对映体分离条件下测得的eei值「(38 .3士0.8)%〕很接近,说明该方法可靠。布洛芬及其正辛酯对映体的手性高效液相色谱法拆分与应用@宋少芳$山东大学胶体与界面化学教育部重点实验室!济南 250100
@黄锡荣$山东大学胶体与界面化学教育部重点实验室!济南 250100
@张文娟$山东大学胶体与界面化学教育部重点实验室!济南 250100
@卢雪梅$山东大学微生物技术国家重点实验室!济南 250100
@曲音波$山东大学微生物技术国家重点实验室!济南 250100手性高效液相色谱;;对映体拆分;;布洛芬;;微乳液凝胶;;固定化脂肪酶;;立 体选择性酯化反应;;对映体过量目的:建立用于测定有机相中脂肪酶促进布洛芬与正辛醇立体选 择性酯化反应转化率及对映体过量值的手性高效液相色谱方法。方法:通过变更流动相组成与配比,找到在ChiralcelOD手性柱上拆分外消旋布洛芬及其正辛酯对映体的最佳色谱条件,建立各自对映体峰面积与浓度之 间的校正关系。结果:以100%正己烷作流动相,布洛芬正辛酯的一对对映体可以分开,布洛芬 则滞留在柱子上;当在正己烷中添加1%冰醋酸后,布洛芬对映体可以分开,但此时酯的对映体分 不开。峰面积-浓度校正曲线表明,布洛芬及其正辛酯各对映体响应因子值相等。结论:可以用峰 面积代替浓度,按有关公式算出布洛芬立体选择性酯化反应的转化率及对映体过量值。鉴于冰醋酸对柱子有害等原因,实际样品分析中直跟踪酯。1HUANG Xi-rong(黄锡荣), LI Yue-zhong(李越中), JIANG Xing-tao (姜兴涛), et al. Immobilization of lipase in water-in-oil microemulsion with gelatin(脂肪酶微乳液的凝胶固定化研究).Chin Pharm Biotechnol(药物生物技术),2000,7(2) :93(in Chinese)
2 XIE Yu-chun(谢渝春),LIU Hui-zhou(刘会洲),CHEN Jia-yong(陈家镛).Chiral HPLC determination of conversion and enantiomeric excess of enzyme catalyzed etereoselective stereoselective of racemic ibuprofen(手性HPLC法测定布洛芬立体选择性酯化的转化率及对映体过量).Chin J Chromatogr(色谱),1998,16(1) :56(in Chinese)
3 XU Shi-wei(徐诗伟).XU Qing(徐清),CAO Gui-fang(曹桂芳), et al. Chiral HPLC determination of enantiomeric excess of S (+)-ibuprofen enantiomer<手性高效液
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