198 5年迄今 ,我们集中进行了灵芝的免疫药理研究和抗肿瘤作用的研究 ,在整体、细胞和分子水平 ,探讨了灵芝的有效成分灵芝多糖的抗肿瘤作用和免疫调节作用的机制 ,特别是探讨了灵芝多糖的抗肿瘤作用的免疫学机制。1 灵芝抗肿瘤作用的免疫学机制2 0世纪 70年代以来 ,国内外学者均重视灵芝的抗肿瘤作用。Ｈｉｔｏｓｈｉ等<1> (1977)报告 ,从灵芝(Ｇａｎｏｄｅｒｍａｌｕｃｉｄｕｍ)中提取的 4种多糖腹腔注射对小鼠Ｓ 180肉瘤的抑制率达 83.9%,半数动物肿瘤完全消退。并推测灵芝的抗肿瘤活性成分是含少量蛋白质的多糖。Ｋｉｍ等<2 > (1980 )报告 ,灵芝子实体经 0 .1ｍｏｌ·Ｌ- 1ＮａＯＨ提取得到一种含 4种单糖和18种氨基酸的蛋白多糖 ,其剂量为 5 0ｍｇ·ｋｇ- 1时对小鼠Ｓ 180肉瘤的抑制率为 87.6 %,1/ 3(5 / 15小鼠的肿瘤完全消退。Ｍｉｙａｚａｋｉ等<3> (1981)从灵芝子实体中分离出一种相对分子质量为 4 0 0 0 0的水溶性多糖 (ＧＬ 1) ,其单糖组成及比例为葡萄糖∶木糖∶阿拉伯糖 =18.8∶1.5∶1.0。腹腔注射ＧＬ 12 0ｍｇ·ｋｇ- 1共 10ｄ ,对小鼠Ｓ 180肉瘤有显著抑制作用。Ｍｉｚｕｎｏ等<4 > (1984 )从灵芝子实体中获得相对分子质量分别为 10 5 0 0 0 0 (Ⅱ )和 4 5 0 0 0 0 (Ⅴ )的两种多糖 ,腹腔注射此二多糖均可抑制ＩＣＲ Ｊｃｌ小鼠皮下接种的Ｓ 180生长 ,半数抑制剂量 (ＩＤ50 )分别为 8.0和 2 2 .0ｍｇ·ｋｇ- 1。李旭生等<5> (1984 )证明 ,灵芝菌丝体提取物对Ｃ3Ｈ小鼠的肌纤维恶性肿瘤有明显的抑制作用 ,对肺部转移病灶亦有抑制作用。为了进一步研究灵芝的抗肿瘤作用及其机制 ,我们首先观察了灵芝在体内的抗肿瘤作用。结果发现从灵芝子实体中提取的灵芝多糖肽不但可抑制小鼠Ｓ 180肉瘤生长 ,还可显著抑制小鼠Ｌｅｗｉｓ肺癌生长 ,5 0ｍｇ·ｋｇ- 1的剂量时抑制率为 5 5 .5 %<5> 。给Ｂａｌｂ/ｃ小鼠皮下接种Ｓ 180肉瘤后 ,灌胃灵芝提取物 5、10、2 0ｇ(生药 )·ｋｇ- 1或灵芝多糖Ｂ 5 0、10 0、2 0 0ｍｇ·ｋｇ- 1,共 10ｄ ,均可抑制Ｓ 180生长 ,抑制率分别为 2 2 .7%、4 1.5 8%、6 0 .89%和 2 7.70 %、5 5 .83%、6 6 .70 %。灵芝多糖Ｂ还可增强抗肿瘤药环磷酰胺(Ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ)的抗肿瘤作用<6～ 9> 。我们还发现灵芝菌丝体多糖 5 0、10 0ｍｇ·ｋｇ- 1灌胃亦可显著抑制Ｂａｌｂ/ｃ小鼠和昆明种小鼠皮下移植的Ｓ 180肉瘤生长 ,其抑瘤率分别为 5 2 .86 %、78.10 %和 37.78%、6 1.79%。以上工作均指出 ,灵芝对动物移植性肿瘤具有抑制作用 ,可使瘤重减轻 ,生存时间延长 ,灵芝所含多糖是其抗肿瘤作用的重要有效成分。然而 ,灵芝的抗肿瘤作用是如何产生的 ?是直接杀死肿瘤细胞 ,还是通过激活机体内部的抗肿瘤作用机制间接杀死肿瘤细胞 ,这些均是目前学术界关注的焦点。为此 ,我们在上述研究的基础上 ,采用血清药理学实验方法及细胞分子生物学技术深入研究了灵芝的抗肿瘤作用机制。首先 ,我们观察灵芝提取物及其所含多糖在体外对肿瘤细胞是否有直接抑制作用。将质量浓度为5 0、10 0、2 0 0ｍｇ(相当生药 )·ｍｌ- 1的灵芝提取物 ,加至体外培养的Ｓ 180细胞培养液中 ,用ＭＴＴ法检测肿瘤细胞增殖活性 ,结果灵芝提取物对Ｓ 180细胞的增殖无直接抑制作用。同样 ,将灵芝多糖Ｂ(5 0～2 0 0 μｇ·ｍｌ- 1)或灵芝菌丝体多糖 (5 .9～ 75 0 μｇ·ｍｌ- 1)直接加入到人白血病细胞 (ＨＬ 6 0 )培养液中 ,对ＨＬ 6 0细胞的生长也无直接抑制作用<7～ 11> 。灵芝是否与一些抗肿瘤药相似能诱导肿瘤细胞凋亡 ?我们采用琼脂糖凝胶电泳法和流式细胞仪检测法观察灵芝对体外培养的肿瘤细胞凋亡的影响。结果发现 ,上述浓度的灵芝提取物不能直接诱导Ｓ 180细胞凋亡 ,而灵芝多糖Ｂ和灵芝菌丝体多糖也不能诱导ＨＬ 6 0细胞凋亡<9～ 11> 。以上结果指出 ,灵芝及其所含多糖既不能直接抑制或杀死肿瘤细胞 ,也不能诱导肿瘤细胞凋亡。灵芝在体内的抗肿瘤作用又是如何产生的呢 ?为此 ,我们采用血清药理学实验方法进行了以下研究 :给小鼠灌胃灵芝提取物 5、10、2 0ｇ(相当生药 )·ｋｇ- 1共 10ｄ ,最后一次给药后 1ｈ ,取血 ,无菌分离血清 ,经 5 6℃ ,30ｍｉｎ灭活处理 ,并经微孔滤膜过滤除菌后 ,置 - 2 0℃冰箱备用。将此含灵芝提取物血清加至体外培养的Ｓ 180细胞中 ,可明显抑制Ｓ 180细胞生长 ,并可诱导Ｓ 180细胞凋亡<7> 。与以上结果相似 ,小鼠灌胃不同剂量的灵芝多糖Ｂ后 ,取出小鼠血清 (含灵芝多糖Ｂ血清 ) ,并观察此血清在体外对ＨＬ 6 0细胞生长的影响。结果可见含灵芝多糖Ｂ血清可显著抑制ＨＬ 6 0细胞增殖 ,并明显地诱导ＨＬ 6 0细胞凋亡。血清药理学的研究结果指出 ,含灵芝提取物或灵芝多糖Ｂ血清中可能含有一种新的药物代谢产物或在药物作用下产生的一种内源性活性物质 ,并因此而产生前述作用。在初步排除含灵芝提取物或灵芝多糖Ｂ血清中有新的药物代谢产物后 ,我们分别采用生物法和ＥＬＩＳＡ法 ,检测含灵芝提取物或灵芝多糖Ｂ血清中肿瘤坏死因子α(ＴＮＦα)和干扰素γ(ＩＦＮγ)的含量。结果显示灵芝提取物 5、10、2 0ｇ(相当生药 )·ｋｇ- 1或灵芝多糖Ｂ 5 0、10 0、2 0 0ｍｇ·ｋｇ- 1灌胃小鼠血清中ＴＮＦα活性和ＩＦＮγ的含量随灵芝提取物或灵芝多糖Ｂ剂量增加而增强 ,并呈现明显的剂量依赖关系<7～ 9> 。已知ＴＮＦα和ＩＦＮγ对肿瘤细胞均具细胞毒作用 ,ＴＮＦα在体外还可诱导多种不同来源的肿瘤细胞凋亡 ,因此含灵芝提取物或灵芝多糖Ｂ血清在体外抑制肿瘤细胞增殖和促进肿瘤细胞凋亡的作用 ,至少与其中所含ＴＮＦα和ＩＦＮγ有关 ,而后二者是在灵芝提取物或灵芝多糖Ｂ作用下 ,在体内生成的。而ＩＦＮγ还可与ＴＮＦα协同作用 ,使后者诱导肿瘤细胞凋亡的作用增强。为了进一步探讨灵芝多糖Ｂ的抗肿瘤作用机制 ,我们在小鼠腹腔巨噬细胞培养中 ,加入质量浓度为 5 0、10 0、2 0 0 μｇ·ｍｌ- 1的灵芝多糖Ｂ共同培养 2 4ｈ ,然后取其培养上清液 (灵芝多糖Ｂ Ｍ ＣＭ)加至ＨＬ 6 0细胞培养液中 ,可显著抑制ＨＬ 6 0细胞增殖并促进其凋亡<8,9> 。这一结果提示 ,在灵芝多糖Ｂ作用下 ,灵芝多糖Ｂ Ｍ ＣＭ中出现一种能抑制ＨＬ 6 0细胞增殖并促进其凋亡的活性物质。经进一步研究证明 ,灵芝多糖Ｂ确有诱导小鼠腹腔巨噬细胞产生ＴＮＦα的作用 ,并呈现明显的量效关系。同上剂量的灵芝多糖Ｂ与小鼠脾淋巴细胞共同培养上清液 (灵芝多糖Ｂ Ｔ ＣＭ)亦能显著抑制ＨＬ 6 0细胞增殖并促进其凋亡 ,这一作用也和灵芝多糖Ｂ与小鼠脾淋巴细胞共同培养上清液中ＩＦＮγ含量增加相一致<8,9> 。同样 ,质量浓度为 12 .5、5 0、2 0 0 μｇ·ｍｌ- 1的灵芝菌丝体多糖与小鼠腹腔巨噬细胞共同培养上清液亦可显著抑制ＨＬ 6 0细胞增殖 ,并促进其凋亡。与此同时 ,上清液中ＴＮＦα的分泌亦明显增加<10 ,11> 。这一结果与Ｗａｎｇ等<12 > (1997)的研究报告一致 ,他们将灵芝子实体多糖 (ＰＳ Ｇ)直接加入ＨＬ 6 0细胞和Ｖ937细胞培养液中 ,既不能抑制此二细胞株增殖 ,也不能诱导它们凋亡。但在此二细胞培养液中加入 2 0 %ＰＳ Ｇ与人外周血单核细胞共同培养液则可显著抑制此二细胞增殖 ,并促进其凋亡。他们还证明 ,在健康人外周血单核细胞或Ｔ淋巴细胞培养液中加入ＰＳ Ｇ的共同培养上清液可明显促进巨噬细胞生成ＩＬ 1β、ＴＮＦα和ＩＬ 6 ,并促进Ｔ淋巴细胞生成ＩＦＮγ。我们还在分子水平研究了灵芝多糖Ｂ对这些细胞因子ｍＲ ＮＡ表达的影响 ,即在小鼠巨噬细胞或脾细胞培养液中加入不同浓度的灵芝多糖Ｂ ,培养 1～ 2ｄ后用ＴＲＩＺＯＬ试剂提取细胞内总ＲＮＡ ,加入相应的细胞因子或内对照 β ａｃｔｉｎ引物和ＲＴ ＰＣＲ反应体系 ,置ＰＣＲ仪中扩增 ,琼脂糖电泳分析扩增产物 ,并用图像分析仪对扩增的泳带进行辉度分析。结果可见灵芝多糖Ｂ可显著促进小鼠腹腔巨噬细胞ＴＮＦαｍＲＮＡ和脾细胞ＩＦＮγｍＲＮＡ的表达水平。同样 ,给小鼠灌胃灵芝提取物 5、10、2 0ｇ(生药 )·ｋｇ- 1共 10ｄ ,亦可显著增加小鼠腹腔巨噬细胞ＴＮＦαｍＲＮＡ表达和脾细胞ＩＦＮγｍＲＮＡ表达<7～ 9> 。最近 ,我们建立了经Ｐ815肿瘤细胞裂解物冲击致敏小鼠骨髓来源的树突状细胞 (ｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌｌｓ ,ＤＣ)诱导产生的特异性细胞毒Ｔ淋巴细胞 (ＣＴＬ)模型 ,在冲击致敏阶段与不同浓度的灵芝多糖 (ＧＬＰ)共培养 ,收集ＣＴＬ及细胞培养上清液 ,将释放入ＣＴＬ与Ｐ815肿瘤细胞共培养体系细胞培养上清液中的乳酸脱氢酶 (ＬＤＨ)活性代表ＣＴＬ的特异性杀伤活性 ;同时用ＲＴ ＰＣＲ法检测ＣＴＬ中ＩＦＮγ及颗粒酶Ｂ(ＧｒａｎｚｙｍｅＢ)的ｍＲＮＡ表达 ;用ＥＬＩＳＡ法检测细胞培养上清液中ＩＦＮγ蛋白含量 ;用ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ法检测ＣＴＬ表达的颗粒酶Ｂ蛋白含量。结果显示 ,当ＤＣ经Ｐ815肿瘤细胞冻
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